Исследование генотоксичности и окислительного стресса лекарственных растений

Автор: Гурбанов Руслан Гурбанович, Джамбетова Петимат Махмудовна

Журнал: Природные системы и ресурсы @ns-jvolsu

Статья в выпуске: 2 т.12, 2022 года.

Бесплатный доступ

Биологически активные вещества (БАВ), содержащиеся в лекарственных растениях, используются при изготовлении лекарственных препаратов, и, соответственно, обладают определенными свойствами, такими как, например, антиоксидативность, противовоспалительный эффект, бактериостатичность, бактерицидность, способностью повышать устойчивость организма к генотоксикантам и т. д. Настои лекарственных растений Душицы обыкновенной (Origanum vulgare) и Чистотела большого (Chelidonium majus), отобранные в местах их произрастания: в горах Ножай-Юртовского (1090 м н.у.м.) и Шатойского (1200 м н.у.м.) районов Чеченской Республики, традиционно используемых в лекарственных целях, были исследованы на индукцию окислительного стресса на штаммах люминесцентных бактерий E. coli. В работе использовались искусственно созданные биосенсорные штаммы Escherichia coli MG1655, содержащие специально сконструированные плазмиды варианта pBR322, несущие оперон luxCDABE бактерии Photorhabdus luminescens, поставленные под индуцируемый промотор, активирующийся лишь при появлении в среде определенных химических агентов. Для детекции веществ, вызывающих оксидативный стресс в клетках, использовали штаммы E. coli, с гибридными плазмидами: pSoxS-lux или pKatG-lux и для детекции генотоксичных веществ - с гибридными плазмидами: pColD-lux или pRecA-lux. Выявили, что изученные лекарственные настои могут оказывать синергетический эффект в комплексе с генотоксичным лекарственным препаратом диоксидином и оксидантом - перекисью водорода. При этом могут выступать и как антиоксидант, и как антигенотоксикант, в зависимости от концентрации. Концентрации настоев Origanum vulgare и Chelidonium majus при концентрации Чистотела большого - 6 г (ЧН2) и 3 г (ЧН3) вызвали оксидативный стресс. Все остальные концентрации Душицы обыкновенной и Чистотела большого на всех биолюминесцентных штаммах E. сoli оказали небольшое бактерицидное воздействие. Дальнейшие исследования биологически активных веществ лекарственных растений позволят предложить их в качестве защитного барьера генотоксического, мутагенного или токсического воздействия различных загрязнителей окружающей среды.

Еще

Душица обыкновенная (origanum vulgare), чистотел большой (chelidonium majus), окислительный стресс, люминесцентные штаммы, escherichia coli, антиоксидант, генотоксикант

Короткий адрес: https://sciup.org/149141230

IDR: 149141230 | DOI: 10.15688/nsr.jvolsu.2022.2.6

Текст научной статьи Исследование генотоксичности и окислительного стресса лекарственных растений

\\Izdatsrv\storage\Олеся\Вестники\Prirodnie sistemy i resursy_2_2022\1_Экология\6_Gurbanov_Dzhambetova.pmd

«t^ §н

DOI:

На сегодняшний день, актуальной и перспективной областью изучения являются лекарственные растения. Обусловлено это рядом факторов: во-первых, все возрастающим интересом людей к доступным, а также недорогим средствам лечения и профилактики различных заболеваний; во-вторых, поиском относительно безвредных активных фармацевтических субстанций; в-третьих, недостаточной изученностью активных соединений лекарственных растений, а также и взаимодействие их с другими биологически активными веществами и лекарственными препаратами.

сти: алкалоиды, гликозиды, смолы, полисахариды, эфирные масла, органические кислоты, кумарины, хиноны, антраценпроизводные, флавоноиды и дубильные вещества [7; 9].

Целью данного исследования было изучение генотоксической/антигенотоксической и ок-сидативной/антиоксидативной активности настоев Душицы обыкновенной ( Origanum vulgare ) и Чистотела большого ( Chelidonium majus ).

Материал и методы исследования

Лекарственные растения Душица обыкновенная ( Origanum vulgare ) и Чистотел большой ( Chelidonium majus ) были отобраны в местах их произрастания: в горах Ножай-Юртовского (1090 м н.у.м.) и Шатойского (1200 м н.у.м.) районов Чеченской Республики.

Для оптимального варианта приготовления настоев с целью минимизации потерь БАВ при воздействии высокой температуры, был выбран следующий метод приготовления настоев. Использовали высушенную надземную часть растения, перемолотая до порошкообразного состояния. Сырье помещают в стеклянную или эмалированную посуду, заливают кипяченой водой, накрывают крышкой и настаивают в течение 15 минут, периодически надавливая на сырье ложкой, затем их отжимают. Объем полученного настоя доводят кипяченой водой до первоначального объема [10]. Настои предварительно стерилизуют ультрафиолетовым облучением.

В работе использовались искусственно созданные биосенсорные штаммы Escherichia coli MG1655 , содержащие специально сконструированные плазмиды варианта pBR322, несущие оперон luxCDABE бактерии Photorhabdus luminescens, поставленные под индуцируемый промотор, активирующийся лишь при появлении в среде определенных химических агентов [4]. Для детекции веществ, вызывающих оксидатив-ный стресс в клетках, использовали штаммы E. coli , которые несли гибридные плазмиды: pSoxS-lux или pKatG-lux. А для детекции генотоксичных веществ использовали данный штамм со следующими гибридными плазмидами: pColD-lux или pRecA-lux. Штаммы любезно предоставлены проф. Абилевым С.К. (ИОГен им. Н.И. Вавилова, Москва).

Культуры клеток E. coli выращивали на среде Луриа-Бертани (LB) с добавлением антибиотика ампициллина (100 мкг/мл). Ночная культура культивировалась в термостате в течение 17 часов при 37 °C до ранней экспоненциальной фазы. Затем она разбавлялась свежей питательной средой до плотности 0,1 ед. Макфарланда. Измерения проводились на денситометре DEN-1 («BioSan» Латвия). Полученную разведенную среду дополнительно культивировали 2 часа при 37 °С аэрируя ее на качалке с 120 об./мин до ранней экспоненциальной фазы. Аликвоты этой культуры (160 мкл) переносили в лунки микропланшета и добавляли туда же, в зависимости от варианта:

– 40 мкл дистиллированной воды при отрицательном контроле;

– смесь из 20 мкл дистиллированной воды и 20 мкл индуктора окислительного стресса / или генотоксического вещества при положительном контроле. В качестве положительного контроля были использованы: диоксидин (0,05 мг/мл) для активации промоторов pColD и pRecA; пероксид водорода (0,01 мкг/мл) для активации промоторов pKatG и pSoxS;

– для оценки отдельных концентраций настоев добавляли 20 мкл исследуемого вещества и 20 мкл дистиллированной воды;

– для оценки совместного воздействия двух настоев на культуру, добавляли 20 мкл исследуемого вещества Душицы обыкновенной и 20 мкл Чистотела большого;

– для оценки общей индукции/ингибиро-вания оксидативного стресса или генотоксического действия, вызванного взаимодействием перекиси водорода / диоксидина с настоями, добавляли 20 мкл исследуемого вещества и 20 мкл оксиданта / генотоксиканта.

Микропланшет со всем его содержимым культивировали при 37 °C и снимали показания в определенные промежутки времени: pColD-lux – 90 мин, pKatG-lux – 45 мин, pSoxS-lux и pRecA-lux – 60 мин. Люминесценция измерялась на микропланшетном лю-минометре Luminometer photometer LM 01A (IMMUNOTECH s.r.o, Czech Republic).

Перечень всех исследуемых концентраций настоев и их комбинаций, а также аббревиатура, представлена в таблице 1.

Отношение интенсивности люминесценции культуры lux-биосенсора, содержащей исследуемое вещество (l_ind), к интенсивности люминесценции контрольной культуры lux-биосенсора (l₀) определяется как фактор индукции по формуле: R = l_ind/l₀. R – фактор индукции. R рассчитан для минимальной (достоверное повышение уровня свечения) и максимальной (максимальный уровень свечения) концентраций настоев по формуле R = Iind /I0, где I0 – уровень спонтанной люминесценции культуры, Iind – уровень индуцированной люминесценции культуры.

Таблица 1

Список исследуемых концентраций настоев

Лекарственное растение	Аббревиатура	Концентрация настоев (на 100 мл)	Лекарственное растение	Аббревиатура	Концентрация настоев (100 мл)
Душица обыкновенная	ДН1	6 г	Чистотел большой	ЧН1	12 г
	ДН2	3 г		ЧН2	6 г
	ДН3	1.5 г		ЧН3	3 г

Результаты исследования

Результаты проведенного исследования представлены в таблицах 2 и 3.

Согласно полученным данным, отдельные концентрации настоев Душицы обыкновенной (Origanum vulgare) и Чистотела большого (Chelidonium majus) не проявили гено- токсической и оксидативной активности (табл. 2), за исключением двух концентраций Чистотела большого – 6 г (ЧН2) и 3 г (ЧН3), которые показали незначительное повышение уровня биолюминесценции по сравнению с отрицательным контролем (в 1,01 и 1,1 раза больше) только на штамме pSoxS, то есть вызвали оксидативный стресс. Все остальные

Таблица 2

Исследование влияния отдельных концентраций Душицы обыкновенной и Чистотела большого на биолюминесцентных штаммах E. Сoli

Lux-штамм	Индукция люминесценции в бакте		риальных lux-биосенсорах, отн. ед.
Lux-штамм	pKatG	pColD	pSoxS	pRecA
Вариант эксперимента	Перекись водорода (0,01 М)	Диоксидин (0,000225 М)	Перекись водорода (0,01 М)	Диоксидин (0,000225 М)
I ind	85323 ± 6305	35798 ± 1507	64861 ± 2211	245638 ± 13548
l 0	7407 ± 93	3632 ± 62	9645 ± 110	114492 ± 2267
I ind /I 0	11,52	9,86	6,72	2,14
Душица обыкновенная
ДН1, 6 г	5885 ± 85	2833 ± 59	8175 ± 239	100444 ± 2687
ДН2, 3 г	5827 ± 133	2814 ± 68	8377 ± 288	95465 ± 3667
ДН3, 1.5 г	5760 ± 155	2981 ± 55	8563 ± 279	95210 ± 4538
Чистотел большой
ЧН1, 12 г	7459 ± 295	1697 ± 76	7690 ± 151	99025 ± 4222
ЧН2, 6 г	6690 ± 114	2529 ± 117	9786 ± 257	101438 ± 4001
ЧН3, 3 г	6229 ± 160	2830 ± 104	10594 ± 464	101704 ± 3097

Примечание. Достоверность определяли по t-критерию Стьюдента, значение составило p < 0,05.

Таблица 3 Исследование влияния комбинаций концентраций Душицы обыкновенной,

Чистотела большого и оксиданта/или генотоксиканта на биолюминесцентных штаммах E. Coli

Вариант эксперимента	Индукция люминесценции в бактериальных lux-биосенсорах, отн. ед
	pKatG	pColD	pSoxS	pRecA
	Перекись водорода (0,01 М)	Диоксидин (0,000225 М)	Перекись водорода (0,01 М)	Диоксидин (0,000225 М)
l ind ,	85323 ± 6305	35798 ± 1507	64861 ± 2211	245638 ± 13548
l 0,	7407 ± 93	3632 ± 62	9645 ± 110	114492 ± 2267
R=l _in d /l 0 .	11,52	9,86	6,72	2,14
Душица обыкновенная + индуктор (перекись водорода/или диоксидин)
ДН1, 6 г	62225 ± 2379	38050 ± 1825	68012 ± 1599	236835 ± 15366
ДН2, 3 г	61534 ± 1288	34946 ± 1328	64332 ± 1145	209723 ± 12074
ДН3, 1,5 г	51884 ± 1011	33938 ± 880	64481 ± 1480	201977 ± 12147
Чистотел большой + индуктор (перекись водорода/или диоксидин)
ЧН1, 12 г	63546 ± 2297	76557 ± 470	73143 ± 854	374793 ± 19324
ЧН2, 6 г	71892 ± 1760	66644 ± 875	90420 ± 2704	309401 ± 9175
ЧН3, 3	71591 ± 931	62028 ± 1736	81396 ± 2210	247962 ± 10089
Душица обыкновенная + чистотел большой
ДН1+ЧН1	7459 ± 329	1501 ± 88	8524 ± 131	85496 ± 4970
ДН2+ЧН2	6768 ± 254	2727 ± 82	10517 ± 244	91660 ± 3394
ДН3+ЧН3	6499 ± 172	3137 ± 72	9638 ± 399	90485 ± 3303

Примечание. Достоверность определяли по t-критерию Стьюдента, значение составило p < 0,05.

изученные концентрации лекарственных растений Душицы обыкновенной ( Origanum vulgare ) и Чистотела большого ( Chelidonium majus ) на всех биолюминесцентных штаммах E. сoli оказали небольшое бактерицидное воздействие.

В таблице 3 представлены данные как совместного действия настоев Душицы обыкновенной с Чистотелом большим, так и отдельное взаимодействие данных концентраций настоев с генотоксикантом/или оксидантом. В качестве генотоксиканта для штаммов pColD и pRecA используется диоксидин (в индукторной концентрации), а для штаммов pKatG и pSoxS в роли оксиданта выступает перекись водорода (в индукторной концентрации).

Исследования совместного действия индуктора и настоев показали, что Душица обыкновенная выступает в основном как ан-тиоксидант/или антигенотоксикант. В свою очередь, Чистотел большой вместе с индуктором, в основном оказывает синергетический эффект, кроме штамма pKatG, где он выступает антиоксидантом.

Обсуждение

Многие лекарственные растения используются как противовоспалительное, противовирусное, антибактериальное, ранозаживляющее, седативное, антиоксидантное, противовоспалительное и противовоспалительное средство, которые могут обладать дезинтоксика-ционным, обезболивающим, гепатопротектор-ным и антисептическим действием [12; 13; 14]. Такое широкий диапазон свойств лекарственных растений обусловлен наличием в их составе множества природных антиоксидантов фенольного класса, которые обуславливают их антиоксидантное, противовоспалительное действие, антимикробное, спазмолитическое и ней-ропротекторное действия [10; 11].

В нашем исследовании были изучены два вида лекарственных растений: Душицы обыкновенной (Origanum vulgare) и Чистотела большого (Chelidonium majus) с использованием люкс-биосенсоров штаммов E.coli, каждый из которых специфически реагируют на различные генотоксические вещества изменением степени люминесценции [6]. Данный тест, наряду с известным тестом Эймса, используют для оценки изучения антиоксидантной и антигенотоксической активности БАВ [2; 8].

В данном исследовании отдельные концентрации настоев Душицы обыкновенной ( Origanum vulgare ) и Чистотела большого ( Chelidonium majus) не проявили генотоксической и оксидативной активности (табл. 2), при этом концентрации Чистотела большого 6 г и 3 г на штамме pSoxS показали незначительное повышение уровня люминесценции по сравнению с отрицательным контролем (в 1,01 и 1,1 раза больше). Все остальные приведенные концентрации на всех штаммах оказали небольшое бактерицидное воздействие, обусловленное наличием в лекарственных растениях фитонцидов.

Исследования совместного действия настоев и индуктора (табл. 3) показали, что Душица обыкновенная выступает, в основном, как вещество антиоксидант или антигенотоксикант, уменьшая воздействие оксиданта или генотоксиканта (то есть индуктора: перекись водорода или диоксидин) на бактериальную клетку. В свою очередь, настои Чистотела большого вместе с индуктором в значительной степени оказывают синергетический эффект, либо увеличивая окислительный стресс в клетке, либо увеличивают повреждение ДНК, кроме штамма pKatG, где настои Чистотела большого выступают в качестве антиоксиданта. В аналогичной работе с данными штаммами бактерий и лекарственными растениями Заилийского Алатау Казахстана было показано также, что настой шалфея способен оказывать антиоксидантный эффект против перекиси водорода [5]. Синергетический эффект настоев Чистотела большого объясняется, возможно, тем фактом, что данное лекарственное растение содержит высокие концентрации алкалоидов [3].

Выводы

Биологически активные соединения лекарственных растений оказывают влияние на метаболизм, в том числе могут нейтрализовать ряд веществ, оказывающих канцерогенное или мутагенное воздействия на наследственные структуры клеток. Активно включаясь в метаболические процессы, они могут нейтрализовать активные формы кислорода и свободные радикалы, активировать ферменты первой и второй фазы детоксикации ксенобиотиков, при этом могут активировать сами ксенобиотики [1].

Таким образом, в связи с вышесказанным, считаем, что требуется дальнейшее изучение биологически активных веществ лекарственных растений как защитного барьера генотоксического, мутагенного или токсического воздействия различных загрязнителей окружающей среды.

Список литературы Исследование генотоксичности и окислительного стресса лекарственных растений

Алтухов, Ю. П. Генетические процессы в популяциях / Ю. П. Алтухов. – М. : Академкнига, 2003. – 431 с.
Антигенотоксическая активность биологически активных веществ в экстрактах Inula britannica и Limonium gmelinii / А. В. Ловинская, С. Ж. Колумбаева, Т. М. Шалахметова [и др.] // Генетика. – 2017. – Т. 53, № 12. – С. 1393–1401. – DOI: https://doi.org/10.7868/S0016675817120086
Журба, О. В. Лекарственные, ядовитые и вредные растения / О. В. Журба, М. Я. Дмитриев. – М. : КолосС, 2008. – 512 c.
Игонина, Е. В. Lux-биосенсоры: скрининг биологически активных соединений на генотоксичность / Е. В. Игонина, М. В. Марсова, С. К. Абилев // Экологическая генетика. – 2016. – № 14 (4). – С. 52–62. – DOI: https://doi.org/10.17816/ecogen14452-62
Изучение антигенотоксической активности настоев лекарственных растений Заилийского Алатау / А. В. Ловинская, Н. Т. Бекмагамбетова, А. Т. Адыбаева [и др.] // Вестник КазНУ. Серия экологическая. – 2019. – Т. 58, № 1. – С. 26–38. – DOI: https://doi.org/10.26577/EJE.2019.v58.i1.03
Индукция окислительного стресса и SOS-ответа в бактериях Escherichia сoli растительными экстрактами: роль гидроперекисей и эффект синергизма при совместном действии с цисплатиной / И. В. Манухов, В. Ю. Котова, Д. Г. Мальдов [и др.] // Микробиология. – 2008. – T. 77, № 5. – C. 590–597.
Масленников, П. В. Содержание фенольных соединений в лекарственных растениях ботанического сада / П. В. Масленников, Г. Н. Чупахина, Л. Н. Скрыпник // Известия РАН. Серия биологическая. – 2013. – № 5. – С. 551–557. – DOI: https://doi.org/10.7868/S000233291305010X
Мачигов, Э. А. Изучение генотоксичности параквата с помощью бактериальных lux-биосенсоров / Э. А. Мачигов, Д. А. Свиридова, С. К. Абилев // Медицинская генетика. – 2020. – № 19 (9). – С. 63–64.
Парийчук, Н. В. Парофазный газохроматографический анализ летучих компонентов лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов: дис. ... канд. хим. наук / Парийчук Нина Владимировна. – Саратов, 2018. – 174 с.
Чукуриди, С. С. Лекарственные растения и их использование в фитотерапии: метод. Пособие для лабораторных и самостоятельных работ студентов по направлению 110400.62 «Агрономия» (бакалавриат) биологических факультетов университетов / С. С. Чукуриди, Л. С. Кричевская, Н. А. Сионова. – Краснодар : Изд-во КубГАУ, 2012.
Composition, antioxidant, antimicrobial and enzyme inhibition activities of two Origanum vulgare subspecies (subsp. vulgare and subsp. hirtum) essential oils / C. Sarikurkcu, G. Zengin, M. Oskay et al. // Industrial Crops and Products. – 2015. – Vol. 70. – P. 178–184. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.03.030
Hypotensive mechanism of the extracts and artemetin isolated from Achillea millefolium L. (Asteraceae) in rats / P. De Souza, A. Gasparotto, S. Crestani [et al.] // Phytomedicine. – 2011. – Vol. 18, № 10. – P. 819–825. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.phymed.2011.02.005
In vitro and in vivo studies of natural products: A challenge for their valuation. The case study of chamomile (Matricaria recutita L.) / S. Petronilho, M. Maraschin, M. A. Coimbra, S. M. Rocha // Industrial Crops and Products. – 2012. – Vol. 40, № 1. – P. 1–12. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2012.02.041
Malathion-induced testicular toxicity in male rats and the protective effect of vitamins C and E / F. Uzun, S. Kalender, D. Durak et al. // Food and Chemical Toxicology. – 2009. – Vol. 47, № 8. – P. 1903–1908. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2009.05.001

Еще

Статья научная