Исследование глютоматергического механизма действия NMDA рецепторного комплекса на безмагниевой модели возникновения эпилептиформной активности в Са1 области гиппокампа крыс

В настоящее время активно разрабатываются препараты для лечения когнитивных расстройств и нейро-дегенеративных процессов с глутаматергическим и гамкэргическим механизмом действия. Одной из главных структур принимающих участие в когнитивных процессах является гиппокамп (центральная структура лимбической системы) которая играет важную роль в процессах памяти и обучения у человека и животных, участвуя, например, в регистрации новой информации, формировании декларативной памяти, эмоций, пространственном обучении и др., а также имеет большое значение в механизмах скорости передачи информации и развития эпилепсии [2, 5, 6, 10]. Из-за сложной дендритной структуры, пирамидные нейроны гиппокампа имеют большие поверхности мембраны по отношению к другим клеткам, а так же большую электрическую емкость с большой постоянной времени мембраны (τm). Это приводит к медленной деполяризации в ответ на возбуждение синаптических входов, и, следовательно, к росту потенциала действия и переменной задержки, которые могут быть вычислены. Тоническая активация NMDA-рецепторов ионами

Mg²⁺ изменяет проводимость мембраны и таким образом регулирует возбудимость нейронов. Кроме того, тоническая активация NMDA-рецепторов, повышает проводимость в мембране уменьшая постоянную времени мембраны (τm) [3]. Следствием изменения (τm) может быть уменьшение или увеличения латентного периода популяционных ответов (ПО) в СА1 области гппокампа при стимуляции коллатералей Шаффера. В регуляции нейропередачи между коллатералями Шаффера и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа NMDA-рецепторный комплекс играет важную роль. Как известно, NMDA-рецепторный комплекс – сложное надмолекулярное образование, включающее в себя сайты специфического связывания с NMDA (и L-глутаминовой кислотой) и глицином (коагонист), а также аллостерические модуляторные сайты, расположенные как на мембране, так и в ионном канале, сопряженном с рецептором [4, 11, 12]. Канал NМDА-рецепторного комплекса блокируется как МК-801 (его специфический неконкурентный антагонист), так и потенциалзависимым образом ионами Mg²⁺, а также он высокопроницаем для ионов Са²⁺ (примерно 10% тока, протекающего через данный канал, осуществляется этими ионами). При этом возможен запуск ряда Са²⁺-зависимых внутриклеточных процессов, одним из которых является эпилептиформная активность. Однако особенности действия блокатора синтеза белка циклогексимида на NMDA-рецепторный комплекс в различных концентрациях на переживающих срезах гиппокампа крыс in vitro изучены недостаточно. Поэтому целью настоящей работы явилось исследование влияния циклогексимида в различных концентрациях на синаптическую передачу в системе коллатерали Шаффера – пирамидные нейроны поля СА1 гиппокампа, а также способность эпилептиформной активности изменять латентный период популяционных ответов.

Задачи исследования:

• 1.    Исследование действия циклогексимида в концентрации, не изменяющей синаптическую передачу.

• 2.    Исследование влияния специфического неконкурентного антагониста NМDА-рецепторного комплекса МК-801 на эффекты возникновение эпилептиформной активности и изменение латентного периода популяционных ответов при удалении ионов Mg²⁺.

Методика исследования.

Эксперименты проведены на переживающих срезах гиппокампа 22 крыс-самцов линии Вистар массой 180– 200 г. Приготовление и инкубирование срезов проводили так, как описано нами ранее [1]. Состав перфузионной среды (мМ): NaCl - 126, KCl - 3, NaH2PO4 - 1,25, MgSO4 - 1,2, CaCl2 - 2, NaHCO3 - 26, глюкоза - 10. Раствор насыщали газовой смесью 95% О2 и 5% CO2 (pH 7,4 при температуре 35±0,5°C). Скорость протока составляла 2 мл/мин. Период адаптации среза к солевой среде продолжался не менее 1 часа, после чего приступали к регистрации исходных показателей. Стимуляцию коллатералей Шаффера производили с частотой 1 Гц (30 импульсов в течение 30 с), регистрируя все популяционные ответы (ПО). Более подробно методика описана нами ранее [1]. Для создания модели эпилептиформной активности удаляли из перфузионной среды ионы Mg2+ [9]. В работе были использованы анализаторные веще- ства – специфический неконкурентный антагонист NМDА-рецепторного комплекса МК-801 (Sigma-Aldrich, США). Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием программ BioStat 2009 Professional и OriginPro 8 SRO. Для оценки значимости различий двух выборок применяли t-критерий Стьюдента.

Результаты исследования:

В I серии экспериментов выявлено, что перфузия переживающих срезов раствором, содержащим циклогексимид в концентрации 200 мкМ (n=5) уменьшал амплитуду (ПО) (1-й стимул – на 78,5 ±1%, p<0,05 30-й стимул – на 91,6±4%, p<0,05), а латентный период (ПО) достоверно не изменял. В концентрации 30мкМ (n=5) достоверно не изменял амплитуду и латентный период (ПО).

Удаление Mg2+ из раствора ACSF содержавшего циклогексимид 30мкМ (n=5) приводило к увеличению амплитуды (ПО) ( 1-й стимул – на 27,5±3,6%, 30-й стимул – на 20,6±7,6%; p<0,05), и латентного периода (ПО) (1-й стимул – на 1,6±0,3 мсек , 30-й стимул – на 1,8±0,15 мсек; p<0,05) и увеличению на 63±3% количества дополнительных (ПО) ( p<0,05) (рис. 1А).

Необходимо отметить, что циклогексимид, оставшийся в растворе ACSF после удаления Mg2+, не предупреждал появление эпилептиформной активности.

циклогексимид 30мкм + 0магния 30 поп.спайк

Рис. 1 А.

Во II серии экспериментов выявлено, что перфузия переживающих срезов раствором не содержащим Mg2+ (n=7) увеличивал амплитуду (ПО) (1-й стимул – на 16,9±6%, p<0,05 30-й стимул – на 20±2,1% (p ≤ 0,05), а латентный период (ПО) уменьшался (1-й стимул на 2,0±0,1 мсек, 30-й стимул – на 1,2±0,3 мсек; p<0,05) и увеличению на 63±3% количества дополнительных (ПО) ( p<0,05), (рис. 1Б)

Добавление в перфузионный раствор МК-801 в концентрации 50 мкМ приводило к возвращению латентного периода и величины (ПО) к контрольному. Причем наблюдалось постепенное уменьшение количества дополнительных (ПО) в зависимости от порядкового номера (от 1-го до 30-го) стимула, а через 40 минут после добавления оно значимо (p < 0,05) уменьшалось на 60±2% (рис. 1В)

Рис. 1 Б. Влияние удаления из перфузионной среды Mg²⁺.

0 Mg + МК-801 50мкм 30 поп.спайк

Рис. 1 В. Эффект добавления в перфузионную среду МК-801 в концентрации 50 мкМ.

Выводы:

Таким образом можно сказать, что блокада синтеза белка циклогексимидом в концентрации 30мкМ не нарушает нейропередачу в системе коллатерали Шаффера – пирамидные нейроны поля СА1 гиппокампа крыс, а в концентрации 200 мкМ почти полностью на 90% ингибирует ее, не вызывая эпилептиформной активности.

Необходимо отметить, что циклогексимид, остававшийся в растворе ACSF после удаления Mg2+, не предупреждал появление эпилептиформной активности. Этот факт говорит о том, что в данной концентрации блокада синтеза белка не влияет на NMDA рецепторный комплекс. Эпилептиформная активность, вызванная удалением Mg2+, уменьшает латентный период (ПО) и увеличивает число дополнительных популяционных ответов, а МК-801 возвращает эти показатели к контрольному уровню. Следовательно нейроны СА1 области гиппокампа опосредуют свое действие через NMDA – рецепторный комплекс.