Исследование хронической токсичности нового антидиабетического препарата на основе гимнемы лесной «Диа-»

Новый потенциальный антидиабетический препарат «Диа-в » ( № патента 2289419 приоритет от 20.12.2004), представляющий собой лекарственную композицию на основе сухого экстракта Gymnema sylvestre (в сочетании с экстрактами гребней Винограда и Девясила Высокого). Результаты исследований антидиабетической активности субстанции препарата «Диа-β» позволяют предполагать наличие у него инкретиномиметического механизма гипогликемизирующего действия [3, 4]. Новое средство планируется использовать в составе комплексной терапии СД в течение длительного времени для лечения и профилактики развития поздних диабетических осложнений.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить хроническую токсичность препарата.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Субстанция препарата «Диа-в» [ № сертификата анализа GYM-030706 от 1.06.2003]. Препарат, содержащий 54,8 % сухого экстракта Гимне-мы лесной, 33,3 % сухого экстракта Девясила и 11,9 % сухого экстракта гребней Винограда, исследовался в дозах 50; 280 и 2800 мг/кг. Эксперименты проводились на 160 половозрелых крысах обоего пола массой тела 180—200 г, доставленных из питомника НИИГТиП (г. Волгоград) и прошедших двухнедельный карантин в виварии

НИИ фармакологии ВолГМУ. Температура воздуха в виварии поддерживалась от +20 до +24о С, освещение — совмещенное. В период проведения экспериментов животные находились в стандартных пластмассовых клетках по 5 особей в каждой, обеспечивались полноценными кормами.

Группам экспериментальных животных (n=20) вводили препарат «Диа-β» внутрижелудочно в течение 6 месяцев. Общая продолжительность хронического эксперимента составляла 7 месяцев (включая 1 месяц отставленных опытов — «отмены»). По ходу эксперимента проводили наблюдения за общим состоянием и поведенческой активностью животных, потреблением корма и воды, состоянием шерстного покрова, динамикой массы тела, регистрируемой два раза в месяц. Состояние гомеостаза оценивали с помощью функциональных, гематологических, биохимических и патомор-фологических методов. Эксперименты проводились в соответствии с методическими рекомендациями проведения доклинических (токсикологических) исследований [1, 2] и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ № 267от 19 июня 2003 г., ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-9).

Поведенческую активность у животных изучали по методу Я. Буреш, О. Бурешовой (1991) в тесте «открытое поле». Состояние сердечно-сосудистой системы оценивали по электрокардиограмме во втором стандартном отведении. Для оценки функционального состояния печени, почек, сердца использовали комплекс биохимических методов исследований плазмы крови с использованием наборов «Био-Ла Тест» (Чехия, Лахема диагностика) и определяли содержание глюкозы, количество общего белка (биуретовая реакция), мочевины (диа-цетилмоноксимным методом), креатинина (цветная реакция Яффе), а также трансаминаз методом Райтмана в реакции 2,4-динитрофенилгидразином с помощью наборов «АлАТ-» и «АсАТ-Импапакт» (г. Москва). Проводили тестовые диагностические пробы — с бромсульфалеином по методу Л. И. Из-райлет (1976), феноловым красным по рекомендациям Е. Б. Берхина и Ю. И. Иванова (1972) и в тесте «гексеналовый сон» по методу М. С. Гижла-рян (1976). В периферической крови у крыс подсчитывали количество эритроцитов и лейкоцитов (мкл), лейкоцитарную формулу по методу Романовского (Е. А. Кост, 1968), измеряли уровень гемоглобина (цианметогемоглобиновый метод, гр/л), цветной показатель эритроцитов (у.е). Влияние препарата на свертывающую систему крови оценивали по методу Мас-Магро (Кост Е. А., 1968) и определяли время свертываемости крови (с).

Статистическую обработку данных проводили с помощью парного t-критерия Стьюдента для сравнения двух или более экспериментальных групп с использованием пакета программ «Statistica 6,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При наблюдении за животными в период шестимесячного внутрижелудочного введения препарата «Диа-β» крысам выявлено их удовлетворительное состояние в течение всего хронического эксперимента. Гибели среди подопытных групп не обнаружено. У испытуемых животных отсутствовали пониженные реакции на звук и тактильные воздействия. Внешнее состояние животных (частота шерстного покрова, состояние слизистых) в течение первых двух месяцев введения препарата не отличалось от группы крыс, находящихся в контроле. Начиная с третьего месяца и в течение 4—5 месяцев эксперимента, как у самок, так и у самцов в группе, получавшей максимальную дозу препарата, превышающую суточную в 10 раз (2800 мг/кг), фиксировались потускнение, постепенное урежение и частичная потеря шерстного покрова. Так, к концу шестого месяца эксперимента аллопеции обнаруживались у 35 % крыс этой группы в области головы, холки, задних конечностей. После отмены введения изучаемого препарата внешний вид экспериментальных животных соответствовал экстерьеру контрольных животных.

При анализе результатов измерений массы тела крыс в трехмесячный период хронического эксперимента было отмечено замедление темпов прироста массы тела у животных получавших дозы 50 и 280 мг/кг на 10 и 15 % соответственно, р≤0,05. Начиная с 4-го месяца эксперимента, масса тела крыс практически не изменялась и была аналогична уровню интактного контроля. В исследованиях, проведенных после отмены введения препарата «Диа-β», темпы прироста массы тела крыс существенно изменились, превалируя над контрольными значениями в 1,5—2 раза.

Поведенческая активность животных несущественно изменялась в группах, получавших вещество в дозах 50 и 280 мг/кг. Прослеживались тенденции ее активации у животных в первый месяц эксперимента (повышение горизонтальной и норковой активности в 2 раза), тогда как в последующие периоды исследований все изменения были на уровне контрольных величин. В исследованиях, проведенных на 3-й и 6-й месяцы эксперимента, достоверных изменений не обнаружено.

При анализе данных исследований электрокардиограмм крыс, получавших изучаемый препарат, в хронических экспериментах существенных изменений не обнаружено.

По результатам исследований периферической крови, отчетливо прослеживается отсутствие существенного влияния на периферическую кровь крыс, получавших препарат в дозах 50, 280 и 2800 мг/кг. В исследованиях, проведенных на 6-й месяц, выявлено, что препарат «Диа-β» в дозе 280 и 2800 мг/кг способствует дозозависимому снижению уровня гемоглобина и росту общего числа лейкоцитов. Вместе с тем данные сдвиги в составе периферической крови оказались в пределах порога физиологической нормы и восстанавливались в исследованиях «после отмены» препарата.

Также не отмечено существенных изменений и по результатам биохимических исследований . Однако под действием препарата «Диа-β» у крыс выявлено достоверное снижение уровня глюкозы во всех опытных группах. Так, в первый месяц исследований в крови крыс-самок зафиксировано (в пределах физиологической нормы) понижение уровня глюкозы (р≤0,05). Аналогичные сдвиги наблюдались у самок и на 6-й месяц исследований. Данный показатель у крыс-самцов достоверно снижался (на 12 %) лишь в первый месяц эксперимента, тогда как в остальные периоды исследований содержание у самцов глюкозы соответствовало контрольным значениям. В исследованиях, проведенных «после отмены», не обнаружено достоверных изменений в величине активности трансаминаз, уровня белка, мочевины, креатинина и холестерина.

При анализе данных функциональных испытаний с наркотическим средством «гексенал», красителем «феноловый красный» и «бромсульфалеи-ном» у подопытных животных выявлены эффекты разной степени выраженности, зависимые как от дозы вещества и пола крыс, так и от длительности эксперимента. Так, в тесте с гексеналовым наркозом у самцов, получавших исследуемое вещество в течение 3 месяцев, прослеживалось дозозависимое увеличение длительности наркотического сна (от 30 % — в дозе 280 мг/кг до 70 % — в дозе 2800 мг/кг, р<0,05). На 6-й месяц исследований достоверное увеличение длительности гексенало-вого сна и укорочение латентного периода зафиксировано практически у всех тестируемых животных. Однако указанные эффекты полностью нивелировались в исследованиях «после отмены». Длительность «гексеналового сна» у крыс самок и самцов практически соответствовала контрольным значениям. В тесте с бромсульфалеином, позволяющем оценить состояние поглотительно-выделительной функции печени в период введения препарата, у подопытных крыс изменений не наблюдалось.

По результатам исследований влияния препарата «Диа-β» на выводящую функцию почек крыс , выявлено увеличение экскреторной функции у крыс, получавших препарат в дозе 50 и 280 мг/кг. При этом в дозе 2800 мг/кг скорость выведения красителя замедлялась только в группе самцов (р≤0,05). У самок экскреторная активность была недостоверно снижена, но количество выделяемого почками красителя не изменялось относительно контрольных значений. После отмены введения «Диа-β», во всех исследуемых группах прослеживалось восстановление до уровня контрольных величин скорости выведения фенолового красного.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований можно заключить, что препарат «Диа-β» относится к классу малотоксичных (достоверно токсической дозы для препарата «Диа-β» не установлено). Кроме того, шестимесячное применение препарата «Диа-β» в терапевтической и субтоксической дозах способствует достоверному снижению уровня глюкозы в крови, массы тела экспериментальных животных и уменьшению площади урежения и частичной потери шерстного покрова. Применение препарата «Диа-β» в дозах 50, 280, 2800 мг/кг не вызывает патологических изменений в ЦНС, сердечно-сосудистой, детоксицирующей и выделительной системах, не изменяет качественного и количественного состава периферической крови, а также не влияет на биохимические показатели плазмы крови крыс.