Исследование иммунотропных свойств сухих экстрактов клевера и цикория на фоне иммуносупрессии

В настоящее время для коррекции иммунодефицитных состояний идет активный поиск новых средств как синтетического, так и природного происхождения, действующих на основные компоненты иммунной системы, причем особенно перспективным является использование средств природного происхождения. Следует отметить, что многочисленные исследования последних лет демонстрируют, что в основе развития различных заболеваний лежит одно и тоже явление, заключающееся в повреждении клеточных оболочек и структур внутри клетки свободными радикалами кислорода [Лущак, 2007]. В данном контексте перспективными являются лекарственные средства, содержащие фенольные соединения, включающие флавоноиды, фенольные кислоты, кумарины, танины и др. [Масная и др., 2013]. Данные соединения проявляя низкую токсичность, оказывают антиоксидантное действие и модифицирующее влияние на структуру биологических мембран лимфоцитов, обеспечивая усиление их пролиферативного потенциала и функции [Зверев и др., 2017].

Среди природных источников фенольных соединений особый интерес представляют клевер луговой ( Trifolium pratense L.) и цикорий обыкновенный ( Cichorium intybus L.), широко распространенные на территории Российской Федерации [Кароматов, Абдулхаков, 2016]. Благодаря богатому комплексу биологически активных веществ (БАВ) данные лекарственные растения оказывают широкий терапевтический спектр фармакологических эффектов, таких как антиоксидантный, антирадикальный, гиполипидемиче-ский, антисклеротический, противоопухолевый, противовоспалительный, ранозаживляющий, антимикробный, антиаллергический и другие [Новиков и др., 2010; Сайбель и др., 2016]. В связи с этим актуальным является оценка иммунопротекторного и антиоксидантного действия сухих экстрактов клевера лугового ( Trifolium pratense L.) и цикория обыкновенного ( Cichorium intybus L.) в отношении параметров врожденного и адаптивного иммунитета при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии.

Цель исследования – оценка влияния сухих экстрактов травы Cichorium intybus L. и травы Trifolium pratense L. на показатели клеточного и гуморального иммунитета, а также выраженности их антиоксидантных свойств при экспериментальной иммуносупрессии, вызванной метотрексатом.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования использовались сухие экстракты, полученные методом перколяции с применением этилового спирта, цикория травы (СЭЦТ) [Патент РФ № 2828665] и клевера травы (СЭКТ) [Патент РФ № 2803502].

Экспериментальные исследования были выполнены на 307 половозрелых беспородных белых мышах-самцах массой 25–30 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с правилами обращения с лабораторными животными, установленными Директивой Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 г. о защите животных, используемых в научных целях, а также Федеральным законом от 27.12.2018 г. № 498-ФЗ «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» (ред. от 27.12.2019). Действие исследуемых экстрактов было изучено на модели иммуносупрессии, индуцированной цитостатиком метотрексатом (MTX) («Сандоз», Словения; лекарственная форма – раствор для инъекций) [Железнова, 2010]. СЭЦТ, СЭКТ и препарат сравнения «Иммунал» мыши получали через 1 ч, 24 ч и 48 ч после введения MTX. Экспериментальные мыши были разделены на 8 групп: 1 группа – интактные мыши, получавшие воду очищенную; 2 группа – мыши, получавшие препарат сравнения «Им-мунал» (ИММ) в дозировке 240 мг/кг, 3 группа – мыши, получавшие СЭЦТ в дозировке 50 мг/кг; 4 груп- па – мыши, получавшие СЭКТ в дозировке 50 мг/кг; 5 группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг; 6 группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и ИММ в дозировке 240 мг/кг; 7 группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и СЭЦТ в дозировке 50 мг/кг; 8 группа – мыши, получавшие MTX в дозировке 10 мг/кг и СЭКТ в дозировке 50 мг/кг.

Изучение особенностей формирования клеточного иммунитета проводили на модели локальной реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ). Для этого животным каждой группы проводили иммунизацию путем внутрибрюшинного введения 10% взвеси ЭБ. Через 4 суток после иммунизации вводили разрешающую дозу ЭБ в подошвенную поверхность стопы, в другую стопу вводили физиологический раствора. Тестирование реакции проводили через 24 ч путем измерения толщины стоп опытной и контрольной лапок [Волчегорский и др., 2000]. Гуморальный иммунный ответ исследовали путем определения прямых антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных животных по методу [Jerne, Nordin, 1963]. Результаты выражали в показателях, характеризующих относительное АОК на 1 млн спленоцитов и их абсолютное содержание на всю селезенку. Определение титра антител к ЭБ осуществляли с помощью реакции геммаглютинации (РГА). Для этого сыворотку крови животных инактивировали при 56°С и затем раститровывали изотоническим раствором хлорида натрия. После раститровки в каждую лунку вносили 2.5% раствор ЭБ и инкубировали в термостате 1 ч при температуре 37°С. После окончания инкубации учитывали результаты РГА по характеру осадка эритроцитов. Полученные титры антител переводили в десятичные логарифмы [Волчегорский и др., 2000]. Количество лейкоцитов определяли в камере Горяева, лейкоформулу периферической крови изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, подсчитывая в каждом мазке не менее 200 клеток, oпределение фагоцитарной активности перитониальных макрофагов проводили по методике [Волчегорский и др., 2000] посредством расчета фагоцитарного показателя (ФП) и фагоцитарного индекса (ФИ).

Определение концентрации тиобарбитуровой кислоты-активных продуктов (ТБКАП) было основано на образовании продуктами перекисного окисления липидов с тиобарбитуровой кислотой окрашенного комплекса (розовый), экстрагируемого бутанолом. Измерение оптической плотности проводили при длине волы 535 и 570 нм («Агат-Мед», Россия). Установление содержания диеновых конъюгатов (ДК) осуществляли спектрофотометрическим методом при длине волны 233 нм [Горина, 2019]. Об активности каталазы судили по способности преобразовывать субстрат (пероксид водорода) в реакции с солями молибдена. Интенсивность развивающейся окраски измеряли на спектрофотометре УФ-1200 («Shanghai Mapada Instruments Co., Ltd», Китай) при длине волны 410 нм [Королюк и др., 1988]. Активность супе-роксиддисмутазы (СОД) определяли по скорости аутоокисления адреналина в адренохром в щелочной среде. Скорость окисления адреналина оценивали по кинетике изменения оптической плотности при длине волны 347 нм [Сирота, 1999].

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета Statistica 10 (StatSoft, USA), включая методы параметрического (критерий Стьюдента) и непараметрического (критерий Манна-Уитни) анализов. Результаты представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентиль), а также в виде среднеарифметического значения (M±m).

Результаты и их обсуждение

В ходе проведённого эксперимента было выявлено, что использование СЭЦТ, СЭКТ, ИММ и цитостатика МТХ не вызывало гибели подопытных животных, что указывает на безопасность исследуемых средств. Исследование числа лейкоцитов и лейкоформулы у мышей всех групп не выявило достоверных отличий подавляющего большинства показателей по отношению к параметрам интактных мышей. Установлено только снижение уровня лейкоцитов и лимфоцитов (4.0*109±0.42 и 51.14±5.9%) у мышей, получавших МТХ по сравнению с контролем (7.2*109±0.46 и 81.5±2.21%).

Для оценки врожденного иммунитета было изучено влияние исследуемых веществ на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов (табл. 1). По сравнению с интактной группой животных было установлено, что ИММ, СЭЦТ и СЭКТ не изменяли фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс, тогда как в группе МТХ отмечалось достоверное снижение фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса. При совместном введении МТХ с ИММ, МТХ с СЭЦТ и МТХ с СЭКТ отмечалось достоверное повышение фагоцитарных показателей по сравнению с их уровнем у мышей, которым вводился только МТХ, кроме того, фагоцитарные показатели в данных группах были близки к параметрам интактных мышей. Таким образом, полученные результаты подтверждают иммунокоррегирующие свойства сухих экстрактов клевера и цикория при совместном влиянии цитостатика по отношению одного из главных параметров врожденного иммунитета – фагоцитоза.

Результаты влияния фитоэкстрактов на клеточный и гуморальный иммунитет выявили, что по отношению к показателям контрольной группы введение иммунала увеличивало титр антител к ЭБ на 30%, относительное количество АОК на 24%, а применение СЭЦТ и СЭКТ значимо не изменяло исследуемые параметры (табл. 2).

Таблица 1

Влияние сухих экстрактов клевера и цикория на фагоцитарные показатели мышей при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии

[Effect of dried extracts of clover and chicory on phagocytic parameters of mice with methotrexate-induced immunosuppression]

№ группы	Группа	n	Фагоцитарный показатель, %	Фагоцитарный индекс
1	ИНТ	12	31 [29; 36]	8.3 [7.3; 8.8]
2	ИММ	10	32 [27; 40]	8.0 [6.6; 8.5]
3	СЭЦТ	11	30 [26; 39]	7.3 [6.6; 8.4]
4	СЭКТ	11	32 [30; 33]	7.7 [7.0; 8.0]
5	MTX	11	26* [25.5; 27.0]	5.9* [5.0; 6.5]
6	MTX+ИММ	13	33^ [29; 37]	7.0^ [6.7; 7.4]
7	MTX+СЭЦТ	11	30 [27; 32]	7.2^ [6.6; 8.7]
8	MTX+СЭКТ	11	34^ [33; 35]	7.5^ [6.3; 8.0]

Примечание: здесь и в следующих таблицах: различия достоверны при р ≤ 0.05: * – по сравнению с животными 1 группы; # – по сравнению с животными 2 группы; ^ – по сравнению с животными 5 группы.

Таблица 2

Влияние сухих экстрактов клевера и цикория на параметры клеточного и гуморального иммунитета при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии

[The effect of dried extracts of clover and chicory on the parameters of cellular and humoral immunity in methotrexate-induced immunosuppression]

№ группы	Группа	Индекс реакции ГЗТ, %	Титр антител, lg	Число АОК на 106 спленоцитов	Абсолютное число АОК на селезенку
1	ИНТ	32 [30; 34] n=15	1.51 [1.51; 2.20] n=8	149 [130; 171] n=8	28583 [17471; 32503] n=8
2	ИММ	35 [29; 53] n=13	1.96 [1.51; 2.40] n=8	185 [162; 199] n=8	29214 [24936; 33066] n=8
3	СЭЦТ	36 [33; 43] n=13	1.96 [1.59; 2.10] n=8	163 [135; 175] n=8	28501 [24283; 32726] n=8
4	СЭКТ	35 [21; 53] n=13	1.82 [1.51; 2.10] n=8	152# [145; 164] n=8	30316 [27675; 32055] n=8
5	МТХ	18*# [17; 23] n=13	0.6 [0.6; 2.10] n=8	124# [104; 140] n=8	18968# [15933; 23774] n=8
6	МТХ+ИММ	25 [15; 43] n=13	0.90# [0.90; 1.82] n=8	136# [121; 146] n=8	22184# [18241; 24459] n=8
7	МТХ+СЭЦТ	27 [17; 45] n=13	1.20 [0.98; 1.43] n=8	127 [100; 144] n=8	23800 [22634; 26522] n=8
8	МТХ+СЭКТ	46*^ [37; 50] n=12	1.67 [1.50; 2.03] n=8	168 [155; 188] n=8	25485 [22652; 28706] n=8

Воздействие цитостатика МТХ приводило по сравнению с интактной группой животных к достоверному снижению индекса реакции ГЗТ, титра антител к ЭБ в 2.5 раза, относительного содержания АОК в 1.2 раза и абсолютного количества АОК на селезенку в 1.5 раза. Одновременное воздействие иммунала и МТХ приводило к достоверному снижению титра антител к ЭБ, относительного и абсолютного содержания АОК и уменьшению индекса реакции ГЗТ в 1.4 раза у мышей 6 группы (МТХ+ИММ) по сравнению с животными 2 группы (ИММ). Вместе с тем, использование иммунала совместно с МТХ (6 группа) уменьшало отрицательные сдвиги исследуемых показателей по сравнению с группой мышей, получавших только МТХ (5 группа).

Аналогичные тенденции изменений изучаемых параметров у мышей наблюдались при введении МТХ и СЭЦТ (7 группа), МТХ и СЭКТ (8 группа). Так при введении СЭЦТ и МТХ отмечалось снижение индекса ГЗТ, относительного и абсолютного количества АОК у мышей 7 группы по сравнению с животными 3 группы. Использование СЭЦТ совместно с МТХ (7 группа) уменьшало отрицательные сдвиги исследуемых показателей по сравнению с группой животных, получавших только МТХ (5 группа). При применении СЭКТ на фоне иммуносупрессии сохранялись те же тенденции изменений исследуемых параметров, как и при использовании СЭЦТ+МТХ.

Таким образом, при введении МТХ совместно с иммуналом, СЭЦТ и СЭКТ наблюдались однонаправленные сдвиги показателей клеточного и гуморального иммунитета, свидетельствующие об имму-нокоррегирующем действии данных препаратов на фоне иммуносупрессии, вызванной МТХ.

Для выяснения механизмов воздействия СЭЦТ и СЭКТ на фоне иммуносупрессии мышей, вызванной МТХ, была проведена оценка выраженности антиоксидантной активности изучаемых экстрактов через определение концентрации продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови и активности ферментов антиоксидантной защиты. Установлено отсутствие значимых различий содержания ТБКАП и ДК у мышей при введении иммунала, СЭЦТ и СЭКТ (табл. 3).

Таблица 3

Влияние фитоэкстрактов клевера и цикория на интенсивность образования ТБКАП и ДК в сыворотке мышей при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии

[Effect of clover and chicory phytoextracts on the intensity of TBCAP and DC formation in mouse serum during methotrexate-induced immunosuppression]

№ группы	Группа	n	ТБКАП, мкмоль/л	ДК, мкмоль/мл
1	ИНТ	6	4.92 [4.62; 5.03]	4.44 [3.39; 5.44]
2	ИММ	6	5.64 [5.18; 6.56]	4.54 [4.25; 5.78]
3	СЭЦТ	6	4.31 [3.79; 4.82]	4.48 [4.33; 4.23]
4	СЭКТ	6	4.18 [4.10; 4.74]	3.39 [3.10; 3.10]
5	МТХ	6	8.54* [7.82; 9.22]	8.74* [8.00; 9.48]
6	МТХ+ИММ	6	5.13^ [4.72; 5.69]	3.46^ [2.81; 4.69]
7	МТХ+СЭЦТ	6	5. 01^ [4.51; 5.21]	3.43^ [2.96; 3.90]
8	МТХ+СЭКТ	6	4.74^ [4.41; 5.69]	3.28^ [2.92; 4.11]

Напротив, при введении мышам МТХ достоверно были увеличены концентрации ТБКАП и ДК в сыворотке крови. В то же время, применение ИММ, СЭЦТ и СЭКТ на фоне МТХ значимо снижало концентрации ТБКАП и ДК, что свидетельствовало о наличии у исследуемых фитосубстанций антиоксидантных свойств.

Для дальнейшего анализа выраженности антиоксидантных свойств изучаемых фитоэкстрактов на данной модели была исследована активность антиоксидантных ферментов. Полученные результаты показали отсутствие существенного влияния СЭЦТ, СЭКТ и ИММ на активность каталазы и СОД, по сравнению с параметрами интактной группы мышей (табл. 4).

Таблица 4

Влияние фитоэкстрактов клевера и цикория на активность каталазы и супероксиддисмутазы у мышей при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии

[Effect of clover and chicory phytoextracts on catalase and superoxide dismutase activity in mice with methotrexate-induced immunosuppression]

№ группы	Группа	n	Каталаза, мкат/л	Супероксиддисмутаза, усл ед/г Hb
1	ИНТ	6	0.14 [0.11; 0.18]	55 [49; 62]
2	ИММ	6	0.18 [0.09; 0.30]	55 [40; 69]
3	СЭЦТ	6	0.20 [0.18; 0.22]	57 [37; 59]
4	СЭКТ	6	0.13 [0.07; 0.27]	49 [45; 58]
5	МТХ	6	0.04* [0.03; 0.05]	26* [25; 30]
6	МТХ+ИММ	6	0.19^ [0.13; 0.20]	48 [35; 54]
7	МТХ+СЭЦТ	6	0.19^ [0.07; 0.20]	56^ [44; 59]
8	МТХ+СЭКТ	6	0.18^ [0.16; 0.20]	55^ [46; 64]

В то же время выявлено достоверное снижение активности данных ферментов у мышей при введении МТХ. При совместном введении экспериментальным животным СЭЦТ, СЭКТ и ИММ на фоне влияния МТХ отмечалось значимое повышение уровня каталазы и СОД по сравнению с параметрами животных, получавших только МТХ, что говорит о способности фитоэкстрактов снижать негативное действие иммуносупрессора.

Заключение

Таким образом, в ходе проведенного исследования влияния СЭЦТ и СЭКТ на клеточный и гуморальный иммунитет, а также их антиоксидантных свойств было установлено, что данные фитосубстанции в условиях иммуносупрессии, индуцированной МТХ, способствуют восстановлению таких параметров, как индекс реакции ГЗТ, титр антител и количество АОК, фагоцитарный индекс и фагоцитарный показатель до значений, сопоставимых с уровнем интактной группы животных, а также повышают активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и каталазы и снижают концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ТБКАП и ДК). Установленное уменьшение развития интенсивности реак- ции ГЗТ при воздействии МТХ, может быть обусловлено тем, что формирование ГЗТ это тимусзависи-мый процесс и при влиянии цитостатика происходит уменьшение регуляторного влияния тимуса [Михайлова, 2014]. Как было показано нами ранее в условиях влияния МТХ имела место гипоплазия вилочкой железы, выражающаяся в снижении массы тимуса и количества тимоцитов [Михайлова и др., 2023]. Изменение гуморального иммунного ответа (уменьшение числа АОК в селезенке и титра антител), установленное у мышей, получавших МТХ, в ответ на Т-зависимый антиген, может быть связано с недостаточностью со стороны Т-хелперов, что в условиях Т-клеточного дефицита представляется весьма вероятным [Михайлова и др., 2024]. Иммунотропные эффекты изучаемых экстрактов клевера и цикория могут быть обусловлены тем, что фитопрепараты способны оказывать непосредственное воздействие на биомембраны клеток, влиять на их структурное состояние, повышать стабильность клеточных мембран, изменять их селективную проницаемость в отношении многих субстанций, оказывать влияние на активность клеточных ферментов [Зиновьев, 2003].

Эффективность действия СЭЦТ и СЭКТ может быть обусловлена совокупным влиянием БАВ, среди которых, вероятнее всего, ведущая роль принадлежит фенольным соединениям, механизм действия которых связан с выраженной антиоксидантной активностью. Многочисленные исследования, проведенные в основном in vitro, показывают, что фенольные соединения, в том числе флавоноиды, могут быть отнесены к неферментным антиоксидантам, способным прямо или косвенно ослаблять, или предупреждать клеточные повреждения, вызываемые свободными радикалами [Murphy, 2011]. При этом большое значение в механизме антиоксидантного действия флавоноидов имеет хелатирование металлов переменной валентности. Флавоноиды легко связывают ионы таких переходных металлов, как железо и медь, которые, инициируя перекисное окисление, способствуют образованию свободных радикалов. По мнению многих исследователей, хелатирование металлов является наиболее эффективным путем подавления процессов перекисного окисления флавоноидами [Шур, Шур, Самотруева, 2019]. Индуцируемый ионами переменной валентности оксидативный стресс ведет к массивному повреждению белков, липидов и особенно ядер клеток, где молекулы ДНК координатно связаны с различными переходными металлами [Halliwell, Gutteridge, 2015, Нотова, Маршинская, 2023]. Исходя из вышеизложенного, связывание переходных металлов, главным образом железа и меди, катализирующих образование свободных радикалов и за счет этого инициирующих оксидативный стресс, представляет собой важную антиоксидантную стратегию [Космачевская, 2024, Быкова, 2015].

Таким образом, особенностью антиоксидантного действия флавоноидов является их комплексный характер, не ограничивающийся повышением уровня антиоксидантных механизмов или нейтрализацией возникающих в результате свободнорадикального окисления токсичных соединений. Это действие осуществляется на разных уровнях, с включением разных структур, в том числе не связанных с прямым антиоксидантным действием.

Анализ полученных экспериментальных результатов позволяет сделать вывод о том, что СЭЦТ и СЭКТ могут быть использованы для дальнейшего изучения в качестве потенциальных лекарственных средств, обладающих иммуномодулирующими ресурсами. Установленные эффекты дают основания рассматривать данные фитосубстанции в качестве перспективных средств растительного происхождения, способных оказывать корректирующее влияние на функциональное состояние иммунной системы, что, в свою очередь, открывает возможности для их применения не только в составе комплексной терапии, направленной на восстановление иммунологической реактивности организма, но и в профилактических целях при различных формах иммунодефицитных состояний.