Исследование экзосомальных микроРНК в плазме крови у пациентов с меланомой, в том числе находящихся в стойкой ремиссии

МикроРНК – это регуляторные РНК длиной около 20 нуклеотидов, регулирующие до 80% генов, при этом обладающие тканеспецифичностью. Уровень микроРНК при патологических процессах в клетках изменяется, а сами микроРНК можно обнаруживать в плазме крови. При онкологических заболеваниях уровень специфичных микроРНК может коррелировать с эффективностью лечения и течением заболевания, а присутствие ряда микроРНК в плазме крови делает их потенциальными маркерами мониторинга заболевания и его прогноза, а в перспективе – подбора адекватной терапии. Тем не менее, как показано в современной литературе, при онкологическом заболевании имеет место значительное увеличение количество экзосом в крови. Это может косвенно говорить о том, что с помощью экзосом происходит как злокачественная трансформация клеток, так и последующая регуляция экспрессии генов в клетках опухоли. Поэтому микроРНК, переносимые экзосомами, могут оказаться значительно более специфичными применительно к исследованию закономерностей онкологических заболеваний.

Экзосомы – это частицы (30–100 нм), состоящие из били-пидной оболочки и со- держащие внутри мРНК, микроРНК и белки, которые выполняют, таким образом, функции информационного межклеточного взаимодействия за счет адресной доставки информации и веществ к лизосомам и плазматическим мембранам других клеток. Экзосомы выделяются при экзоцитозе поздних эндосом всеми клетками организма. Конкретный состав экзосом уникален и зависит от типа клеток, в которых они образуются.

В результате анализа данных литературы были подобраны следующие 17 микроРНК: hsa-miR-214–3p, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-155–5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-149–5p, hsa-miR-221–3p, hsa-miR-222–3p, hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-miR-24–3p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-211–5p, hsa-miR-21–5p, hsa-miR-137, hsa-miR-145–5р, hsa-miR-34а, hsa-miR-17–5p, специфичные для меланомы. В перечень исследуемых микроРНК включались как тотальные микроРНК (выделяемые из плазмы крови напрямую), так и экзосомаль-ные, содержащиеся в экзосомах и выделяемые из них. Задачей нашей работы было провести выделение перечисленных микроРНК из плазмы крови и из экзосом, и, оценив уровни и найдя корреляции с клиническими проявлениями заболевания, сформировать панель маркеров.

Материалы и методы. В работу взяли 40 образцов крови, из которых 20 от пациентов с меланомой, получающих курс лечения, 14 от людей, которым был поставлен диагноз «меланома», но признаки заболевания отсутствуют длительное количество времени (от 5 до 15 лет), а также 6 – от здоровых людей (контрольная группа). Кровь брали в объеме 2,5 мл в пробирку с ЭДТА, после чего проводили центрифугирование при 5 000 оборотах в течение 10 минут на центрифуге. Выделение экзосом проводили при помощи наборов miRCURY Exosome Isolation Kit. Выделение микроРНК из плазмы крови проводили по стандартному протоколу на наборе miRCURY RNA Isolation Kit – Biofluids, выделенную тотальную микроРНК сразу же подвергали обратной транскрипции на наборе Universal cDNA Synthesis Kit II. Полученный материал замораживали на –20 С или брали для проведения ПЦР в реальном времени на наборе ExiLENT SYBR Green Master Mix Kit с праймерами на специфические микроРНК.

Результаты. В результате исследования, уровень большинства взятых в работу микроРНК удалось опередить у всех образцов. По итогам сопоставления с историями болезни выявлен ряд строгих закономерностей, по которым можно сделать вывод о специфичности ряда экзосомальных и тотальных микроРНК по отношению к агрессивности протекания заболевания, успешности тактики лечения, и характеру иммунного ответа организма.

Заключение. Показана принципиальная возможность выделения и анализа микроРНК из экзосом и плазмы крови у пациентов с меланомой. Сформирована панель эпигенетических маркеров, которая после дополнительных исследований может применяться для подбора терапии и контроля ее эффективности, а также прогноза злокачественных трансформаций.

Для дальнейшей работы и возможности применения тест-системы в клинической практике необходим набор дополнительного биологического материала. Исследования продолжаются.

• № 4, Special Edition 1 – 2016 г. (21) • MALIGNANT TUMOURS 339