Исследование морфологической картины пульпы зубов и периодонта при применении донора оксида азота и блокатора NО-синтазы при эмоциональном стрессе

Работами отечественных исследователей было показано, что важную роль в повреждении тканей пародонта играют стрессорные воздействия, т.к. в результате активации адренергической и гипоталамо-гипофизарно-ад-реналовой систем происходят нарушения различных видов обмена, чрезмерная активация процессов перекисного окисления липидов, расстройства регионарной гемодинамики, что приводит к деструкции клеточных мембран пародонтальных тканей [2, 13].

В предыдущие годы Ф.З. Меерсоном (1981) была выдвинута концепция о стресс-лимитирующих системах организма, которая дала реальную основу для разработки принципов предупреждения чрезмерной активности стресс-реакции и реализации ее патогенных воздействий на различные органы и системы организма [9]. В механизме адаптации наиболее важную роль играют универсальные факторы регуляции физиологических систем и экспрессии генов [6].

Согласно современным представлениям, таким универсальным регулятором является оксид азота (NO) [7, 8]. В организме NO синтезируется из L-аргинина ферментом NO-синтазой. С начала 90-х годов стали появляться доказательства того, что NO вовлечен в регуляцию активности генетического аппарата как на уровне факторов транскрипции, так и на уровне самих механизмов транскрипции и трансляции мРНК [14, 15].

Наконец, после того как были получены данные о значительных изменениях в продукции NO при стрессе и в процессе адаптации к разным факторам, возникло предположение о том, что NO играет важную роль в стрес-сорных и адаптивных ответах организма [12]. Учеными выдвинута гипотеза о том, что NO участвует в регуляции стресс-реакции, ограничивая ее чрезмерную активацию и ее повреждающие эффекты как на центральном, так и на периферическом уровне [5, 11].

Цель исследования: изучение морфологических особенностей пульпы и периодонта зубов под влиянием эмоционального стресса в ответ на использование активаторов и ингибиторов фермента NO-синтазы в эксперименте.

Материал и методы

Экспериментальные исследования проведены на 220 белых крысах-самцах линии Вистар массой 180–220 г в осенне-зимний период. Все исследования на животных проведены с соблюдением требований приказа № 724 Минздрава СССР от 13.11.1984 г. “Правила проведения работ с экспериментальными животными”. В качестве модели стресса выбрана методика эмоционально-болевого стресса путем 6-часовой иммобилизации животных на спине. Всех подопытных животных разделили на 4 основные группы. В первой группе исследовались морфологические особенности пульпы зубов и пародонта крыс без стрессорного воздействия в норме (n=20). Во второй группе изучались морфологические изменения тканей пульпы и пародонта через 39 ч после окончания шестичасовой иммобилизации животных (n=60). В третьей и четвертой группах изучались те же показатели через 39 ч после стрессорного воздействия на фоне введения донора молекул оксида азота – L-аргинина (n=70) либо блокатора фермента NO-синтазы – L-NNA (n=70).

В качестве донора молекул оксида азота (NO) использовалась аминокислота L-аргинин в дозе 200 мкг/кг веса за 30 мин до иммобилизации и через 30 мин после окончания стрессорного воздействия. Блокатор фермента NO-синтазы – N-нитро-L-аргинин (L-NNA) в дозе 50 мг/кг вводился за 30 мин до начала иммобилизации и через 30 мин после окончания стрессорного воздействия для снижения продукции NO.

Для морфологического анализа забранный материал фиксировали в забуференном 10%-м нейтральном формалине и заливали парафином по общепринятой методике. Декальцинация блоков проводилась Трилоном Б. Срезы стандартной толщины (5 мкм) окрашивались гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону. Морфометрическое исследование выполнялось с использованием измерительной сетки со 100 равноудаленными точками Г.Г. Автандилова для цито-гисто-стереометрических исследований, накладываемой на фотоснимок на экране монитора произвольно выбранного поля зрения [1]. Методом точечного счета определялись относительные объемы, занимаемые фибробластами, пульпоцитами, аморфным веществом, сосудами, коллагеновыми волокнами, сегменто-ядерными лейкоцитами. Подсчет производился в каждом случае в 20 различных полях зрения при увеличении микроскопа х100.

Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с помощью программы Statistica 6.0 StatSoft. Различия между группами независимых количественных показателей определялась по U-критерию Манна–Уитни для непараметрических величин по формуле: U=T–nM(nM+1)/2, где Т – сумма рангов наименьшей из сравниваемых групп. Уровень различий рассматривался как статистически значимый при р<0,05 [4].

Результаты

Ранее нами установлено, что у крыс при эмоционально-болевом стрессе реакция гипофизарно-адреналовой системы имеет фазный характер [2]. Первый период – от начала стрессорного воздействия и до 36 ч после его окончания – соответствует стадии тревоги и характеризуется повышением уровня кортикостерона в плазме крови крыс и развитием выраженной эозинопенической реакции. Второй период, соответствующий моменту перехода стадии тревоги в стадию резистентности, характеризуется пиком эозинофилии к 39 ч и снижением уровня кортикостерона до показателей контрольной группы. Третий период – начиная с 42 ч – соответствует стадии резистентности и характеризуется постепенной нормализацией биоритма эозинофилов и снижением уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных до показателей, близких к норме.

Изменения структуры пульпы зубов и пародонта по степени и распространенности достигали максимальной выраженности к 39 ч после окончания стрессорного воздействия, что соответствует переходу стресс-реакции из стадии тревоги в стадию резистентности [3]. В пульпе зубов они характеризовались разрыхлением слоя одонтобластов, полнокровием, появлением мелких вакуолей. Одонтобласты в области разрыхления оказались деформированы. Данные изменения соответствовали состоянию гидропической (вакуольной, водяночной) дистрофии. Размеры, количество и расположение вакуолей какой-либо системы не имели. В ряде полей зрения встречались группы гиперхромных одонтобластов, которые обнаруживались только в области шейки на язычной поверхности зуба. Основное вещество пульпы отличалось очаговой базофилией и менее компактным расположением волокнистых структур, разделенных оптически пустыми более или менее широкими пространствами. Развившиеся преобразования свидетельствовали в пользу обратимой дезорганизации соединительной ткани – мукоидного набухания. Выявленные изменения имели неравномерный характер, занимая не более трети площади пульпы в каждом зубе.

При морфологическом анализе тканей пародонта спустя 39 ч после окончания шестичасовой иммобилизации животных на спине установлено, что количество клеточных элементов периодонта возрастало по направлению к верхушке корня зуба и от центра периодонтальной щели к поверхности цемента. Основную массу клеток периодонтальной щели составляли фибробласты. Они, в основном, имели веретенообразную форму, иногда встречались отростчатые клетки. Наряду с этим наблюдалась миграция небольшого количества нейтрофильных лейкоцитов за пределы сосудов. В окружающей ткани определялся отек с увеличением пространств между коллагеновыми волокнами с некоторым набуханием последних.

Подводя итог результатам морфологического исследования пульпы и периодонта крыс через 39 ч после окончания шестичасовой иммобилизации, можно сделать вывод о развитии существенных гемодинамических расстройств, вызванных стрессом. Установленные нарушения проявлялись неравномерным артериальным и венозным полнокровием, гемостазом, диапедезными кровоизлияниями, умеренным лейкодиапедезом и макрофагальной реакцией. Выявленные структурные изменения были обратимыми, без дальнейшей отрицательной динамики.

Решая следующие задачи работы, мы изучили возможности ограничения выраженности стрессорных повреждений тканей пульпы зубов и периодонта у животных оксидом азота (NO) путем введения доноров и блокаторов фермента NO-синтазы. Было установлено, что слой одонтобластов в пульпе зубов крыс третьей группы состоит из нескольких слоев. Одонтобласты имели преимущественно грушевидную форму, базофильную мелкозернистую цитоплазму, вытянутые и округлые ядра. В части полей зрения в пульпе резцов в области шейки с язычной поверхности зуба определялись немногочисленные одонтобласты с заметно гиперхромными ядрами. Состав, распределение и количество клеточных элементов центральных отделов пульпы в этой подгруппе мало отличались от таковых в группе сравнения. Сосудистая реакция в виде расширения сосудов и их полнокровия умеренной выраженности наблюдалась во всех случаях данной группы и была неравномерной. В артериях наблюдалось утолщение эндотелия. Сосуды венозной системы оказались расширены более значительно, местами отмечались гемостазы и краевое стояние нейтрофильных лейкоцитов.

В периодонте после стресса на фоне введения молекул оксида азота L-аргинина наблюдалось формирование сосудистого и клеточного ответа. Сосуды были расположены типично для нормального состояния периодонта, т.е. ближе к стенке альвеолы. Эндотелий сосудов не имел признаков дезорганизации, ядра эндотелиальных клеток по структуре не отличались от контроля. Во всех исследуемых группах отмечены полнокровие, диапедезные кровоизлияния и гемостазы. Однако после стрессорного воздействия кровенаполнение сосудов имело неравномерный, преимущественно умеренный характер. Кровоизлияния и стазы крови оказались немногочисленными и выявлялись в небольшом числе наблюдений. Явления стаза в сосудах наблюдались в основном в маргинальном отделе. В сосудах собственно периодонта выявлено краевое стояние нейтрофильных лейкоцитов. Ядра эндотелия в своем большинстве существенно не различались с ядрами нормального эндотелия сосудов периодонта. Целостность эндотелиальной выстилки сосудов не нарушалась.

Изменения клеточного состава характеризовались увеличением размера небольшого числа фибробластов, ядра которых были четко очерчены, а цитоплазма – легко базофильна. Вблизи цемента наблюдалось больше молодых фибробластов, с нечетко контурирующейся цитоплазмой и овальной формы ядрами. Выявлены единичные митозы фибробластов в периодонте, что свидетельствовало о высокой функциональной активности этих клеток. Вокруг кровеносных сосудов располагались единичные лимфоциты, плазмоциты, нейтрофилы, эозинофилы. Граница между остеонным и безостеонным слоем альвеолы была четкой. В костной ткани ядра остеоци-тов располагались эксцентрично, часть костных лакун оказалась свободной от клеток. По краю альвеолы безос-теонный слой был неравномерной ширины, коллагеновые волокна проходили на всю его глубину, границы их различались. Четко прослеживалась и граница перехода пучков коллагеновых волокон из периодонта в безосте-онный слой.

Таким образом, сравнение структурных изменений тканей пульпы и периодонта крысы в условиях активации стресс-лимитирующих систем с контролем показало, что через 39 ч после стрессорного воздействия на фоне введения аминокислоты L-аргинина развиваются очаговая дистрофия одонтобластов, а также сосудистые реакции в виде неравномерного полнокровия, немногочисленных гемостазов, слабо выраженного лейкодиапе-деза, участков отека. Индуцированная активация фермента NO-синтазы позволила свести к минимуму гемодинамические расстройства и вызванные этим повреждения структурных компонентов исследуемых тканей.

В четвертой группе животных, которым вводился блокатор NO-синтазы L-NNA, морфологические изменения установлены во всех структурных компонентах пульпы и периодонта. Слой одонтобластов на большем протяжении имел неравномерную толщину, оказался разрыхлен, не обладая четкими границами, сливался с субодонтоб-ластическим слоем. Одонтобласты в участках разрыхления деформировались, приобретали чрезмерно вытянутую и неправильную форму. Во многом это было связано с образованием многочисленных вакуолей, располагавшихся преимущественно в базальной части клеток. Вакуоли имели округлую форму, различную величину, местами сливались, формируя относительно крупные полости, выступающие за пределы слоя одонтобластов (баллонная дистрофия). Число и размер вакуолей оказались значительно больше, чем в других группах. Значительная часть одонтобластов характеризовалась более интенсивной базофилией цитоплазмы по сравнению с нормой.

Кровоизлияния занимали 9,3% площади среза. Транссудация жидкой части крови в основное вещество пульпы сопровождалась отеком основного вещества, который местами достигал выраженной степени. В результате этого часть пучков коллагеновых волокон, расположенных в центральных отделах пульпы, разволокнялась, а строма в целом имела неравномерную плотность. В этих полях зрения волокнистые структуры изменяли тинктори-альные свойства в сторону базофилии, что служит проявлением мукоидного набухания. Пучки волокон располагались вдоль оси зуба или под небольшим углом к ней.

Эмиграция лейкоцитов подтверждалась их присутствием в небольшом количестве вблизи сосудов центральной части пульпы. Здесь определялись макрофаги, в цитоплазме которых имелись мелкие вакуоли. Макрофагальная реакция, выявленная у 57,5% животных, отличалась увеличением числа макрофагов в сравнении с другими группами.

При морфологическом исследовании периодонта крыс, подвергнутых иммобилизации, установлено, что после введения блокатора фермента NO-синтазы, так же, как и в контрольной группе, пучки коллагеновых волокон периодонта располагались разнонаправленно. Переплетаясь между собой, они образовывали сеть, пронизывали всю толщу цемента, обеспечивая соединение зуба с периодонтом. Границы коллагеновых волокон на всех уровнях имели не везде четкие контуры, что обусловлено неравномерной степенью выраженности отека. Цемент, подобно таковому в группе контроля, по строению оказался подобен безостеонному слою стенки альвеолы. Кровеносные сосуды располагались как параллельно длинной оси зуба, так и в виде спирали вокруг корня.

Таблица 1

Морфометрические показатели пульпы зуба крысы при иммобилизационном стрессе (M±m)

Структурные компоненты (%)	Контроль (n=20)	Через 39 ч после иммобилизации
		Без премедикации (n=60)	На фоне введения L-аргинина (n=70)	На фоне введения L-NNA (n=70)
Пульпоциты	14,7±0,49	10,9±1,71	12,2±1,22	7,65±0,98
Аморфное вещество	31,4±0,54	40,1±0,83	34,6±0,73	38,45±0,91
Сосуды	13,1±0,77	19,5±0,65	16,3±0,67	29,7±0,74
Коллагеновые волокна и фибробласты	40,8±0,74	29,2±0,62	36,7±0,58	23,6±0,55
Сегменто-ядерные лейкоциты	0	0,3±1,31	0,2±1,23	0,6±1,54
Количество одонтобластов	8,5±1,87	8,1±1,24	8,2±1,24	6,2±0,53
Толщина слоя одонтобластов, мк	22,3±1,5	23,8±2,35	20,7±1,24	28,9±1,37
Высота одонтобластов, мк	11,4±1,11	13,9±2,08	9±2,24	13,5±1,03
Диаметр сосуда	24,8±2,05	32,3±1,04	29,6±1,24	35,4±1,06

Таблица 2

Морфометрические показатели пародонта крысы при иммобилизационном стрессе (M±m)

Структурные компоненты (%)	Контроль (n=20)	Через 39 ч после иммобилизации
		Без премедикации (n=60)	Введение донора молекул оксида азота L-аргинина (n=70)	Введение блокатора фермента NO-синтазы L-NNA (n=70)
Аморфное вещество	25,9±0,45	31,4±0,35	28,5±0,54	37,6±0,39
Сосуды	7,8±0,81	14,9±0,43	10,8±0,69	21,4±0,69
Коллагеновые волокна и фибробласты	66,3±0,47	53,6±0,48	60,5±0,32	40,8±0,69
Сегменто-ядерные лейкоциты	0	0,1±1,13	0,2±1,14	0,2±1,69

Около альвеолярной кости определялась более густая сосудистая сеть. В маргинальных отделах периодонта наблюдались сосудистые изменения в виде неравномерной – от умеренной до выраженной – венозной гиперемии, признаков гемостаза, краевого стояния лейкоцитов с явлениями нарастающей клеточной эмиграции.

С целью объективизации полученных результатов в тканях пульпы и пародонта крыс при изучаемых вариантах стрессового воздействия осуществлен морфометрический анализ (табл. 1, 2).

Таким образом, в пульпе и периодонте крыс, подвергшихся иммобилизации на фоне введения блокатора фермента NO-синтазы, развивались очаги повреждения в слое одонтобластов и эндотелии сосудов с гибелью части их клеток. Гемодинамические расстройства сопровождались распространенными гемостазами, различных размеров кровоизлияниями, отеком, лейкодиапедезом и макрофагальной реакцией. Данные изменения имели более выраженный, чем в других исследуемых группах характер, являясь частью необратимыми.

Заключение

Полученные результаты дают основания считать, что при длительном и тяжелом стрессорном воздействии, сопровождающимся сильным болевым и психоэмоциональным напряжением, в тканях пульпы и периодонта возникают распространенные гемоциркуляторные и очаговые альтеративные изменения. Это создает условия для развития воспаления и нарушения процессов репарации. Представленные нами данные показали, что использование доноров молекул оксида азота L-аргинина способствует ограничению стрессорного повреждения тканей пульпы зубов и периодонта при длительных эмоционально-болевых воздействиях.