Исследование неферментативного взаимодействия селена и серебра с цистеином и глутатионом с помощью приборного комплекса МХ-5310

ВВЕДЕНИЕ                   сутствующего в сопоставимых с GSH количествах

Антиоксидантная роль селена (Se) впервые была выявлена английским биохимиком А. Диплоком в 1970 г. [1]. В основе этого процесса лежит взаимодействие Se с глутатионом (GSH) [2].

GSH присутствует в клетке в восстановленном состоянии (SH) в концентрации около 5 мМ. Фактически такая высокая концентрация GSH в клетке приводит к тому, что он может восстанавливать любую дисульфидную связь (S–S), образующуюся между цистеинами цитозольных белков. При этом восстановленная форма GSH превращается в окисленную форму GSH — дисульфид глутатиона (GSSG). GSSG может быть восстановлен под действием фермента глутатионредуктазы, который постоянно находится в клетке в активном состоянии и индуцируется при оксидативном стрессе [1]. Важную роль в этих процессах выполняет Se, участвуя главным образом в функционировании Se-зависимых глутатионпероксидаз. Было показано, что процесс окисления GSH в безфер-ментативной среде ускоряется в присутствии Se (обычно в виде SeO 2 ). При этом зарегистрировано образование двух типов продуктов — окисленной формы GSH (GS-SG) и Se-дисульфида глутатиона (GS-Se-SG) [2]. Представляло интерес в рамках настоящей работы изучить особенности этого неферментативного взаимодействия Se с GSH, а также влияние на этот процесс другого сульфгидрильного соединения — цистеина (Cys), при-

во многих биологических средах [1–2].

В связи с тем что постулируется участие GSH в дезинтоксикации тяжелых металлов [3], представлялось целесообразным проверить возможное конкурентное участие в этом процессе Se на примере изучения воздействия на этот процесс ионов серебра, относящегося также к классу тяжелых металлов.

Для изучения особенностей неферментативного взаимодействия GSH и Cys с Se (в виде SeO 2 ) и в том числе в присутствии ионов серебра использовались два инструментальных метода: масс-спектрометрия с электрораспылением (ESI-o-TOF-MS) — для качественной и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — для количественной оценок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Независимое взаимодействие SeIV с GSH и SeIV с Cys

Для исследования взаимодействия SeIV с GSH и SeIV с Cys использовались смеси этих соединений в различных концентрациях. На рис. 1 представлены масс-спектры реакционных смесей, полученных при взаимодействии SeIV с GSH (а) и SeIV с Cys (б) в молярном соотношении 1:1 в водной среде.

Рис. 1. ESI-масс-спектры реакционных смесей, полученных при взаимодействии Se^IV с GSH (а) и Se^IV с Cys (б)

Из рис. 1 следует, что в реакционных смесях образовались продукты окисления, а именно дисульфид глутатиона (GS-SG), представленный в масс-спектре двухзарядным ионом с m / z = 307.08 и однозарядным ионом с m / z = 613.16 (рис. 1, а), и дисульфид Cys (Cys-Cys) в виде только однозарядного иона с m / z = 241.04 (рис. 1, б).

Кроме того, наблюдается образование Se-содержащих продуктов для GSH (GS-Se-SG), представленных в масс-спектре двухзарядным ионом с m / z = 307.3 и однозарядным ионом с m / z = 693.16 (рис. 1, а), а для Cys-содержащих продуктов — Se-дисульфида (Cys-Se-Cys) (рис. 1, б). Все Se-содержащие продукты имеют изотопное распределение, характерное для Se.

В настоящей работе проведен количественный анализ образующихся продуктов в смеси SeIV с GSH с помощью ВЭЖХ. Результаты обработки полученных данных при различных количествах SeIV и GSH в водной среде представлены в табл. 1. Там же представлены данные по спонтанному окислению GSH без SeIV. Концентрации всех продуктов выражены в процентах, рассчитанных из площадей соответствующих хроматографических пиков, что отражает распределение в них глутатиона.

Из табл. 1 видно, что уже через 5 мин наблюдается значительная убыль GSH и появление продуктов окисления, основным из которых при соотношениях с Se и GSH 1:1 и 1:2 является GS-Se-SG. Отметим, что контрольный эксперимент показал, что в тех же условиях, но без Se окисление GSH не наблюдается по крайней мере в течение часа. Отметим, что доминирование образования GS-Se-SG, возникающее на первых 5 минутах, сохраняется в течение длительного времени (~20 ч).

Как показывают результаты представленные в табл. 2, в присутствии бикарбоната аммония (рН 7.4) ускоряется как реакция GSH с Se, так и скорость спонтанного окисления. В 1 %-й уксусной кислоте скорость взаимодействия с Se замедляется. При этом как в водной среде, так и в присутствии уксусной кислоты, спонтанное окисление GSH в отсутствие Se не наблюдается. Из анализа полученных результатов может быть сделан вывод о том, что увеличение в продуктах реакции доли окисленной формы (GS-SG) при переходе от кислой к щелочной среде связано с изменением концентрации непротонированных сульфгидрильных групп GSH, необходимых для образования этой формы, в то время как образование GS-Se-SG не зависит от рН. В конечном итоге это приводит к перераспределению конечных продуктов реакции и значительному изменению соотношения GS-SG и GS-Se-SG.

Табл. 1. Количественные характеристики реакционных смесей и продуктов реакции

№ п/п	Исходные реагенты		Время реакции, мин	Состав продуктов, содержащих глутатион, %
	SeIV, мМ	GSH, мМ		GSH	GS-SG	GS-Se-SG
1	0.33	0.33	5	9	27	64
2	0.165	0.33	5	31	21	48
3	0.165	0.33	60	5	25	70
4	0.165	0.33	1140	0	26	74
5	0	0.33	60	100	0	0

Табл. 2. Состав реакционной смеси окиси селена и глутатиона при соотношении 1: 1 в разных средах

№ п/п	Реакционная среда	Время реакции, мин	Состав продуктов, содержащих глутатион, %
			GSH	GS-SG	GS-Se-SG
1	Вода	5	9	27	64
2*	— ” —	60	100	0	0
3	20 мМ NH 4 HCO 3	5	0	69	31
4*	20 мМ NH 4 HCO 3	5	96	4	0
5	1 % CH 3 COOH	14	16	20	64
6	1 % CH 3 COOH	90	0	21	79
7*	1 % CH 3 COOH	60	100	0	0

Примечание. * — контроль без селена.

Bit

1800 000

GS-Cys 427.24

а

1600 000

1400 000

1200 000

1000 000

800 000

600 000

400 000

200 000

50 000

Cys-Cys

241.11

+2 (GS-Se-SG) 347.16

GSH 308.19

GS-Se-Cys

50719              GS-Se-SG

GS-SG 693.33

613.38 I

100    150   200    250    300   350   400   450   500    550   600    650   700    750 800

m / z

Рис. 3. ESI-масс-спектры реакционных смесей, полученных при взаимодействии Se^IV с GSH и Cys при эквимолярном соотношении концентраций Se^IV и сульфгидрильных соединений 1:1:1 (а) и при концентрации Se, в 2 раза уменьшенной — 1: 2 : 2 (б)

Конкурентное взаимодействие сульфгидрильных групп цистеина и глутатиона с селеном

Свободный цистеин, являющийся предшественником глутатиона, присутствует в биологических жидкостях одновременно с глутатионом. Оба соединения являются компонентами антиоксидантной защиты организма человека. Наличие в каждом из них свободной сульфгидрильной группы позволяет обоим соединениям конкурировать друг с другом при взаимодействии с селеном.

В настоящей работе были проведены масс-спектрометрические и хроматографические иссле- дования взаимодействия SeIV с GSH и Cys при различных концентрациях SeIV и сульфгидрильных соединений.

На рис. 3 представлены результаты масс-спектрометрической детекции смесей Cys и GSH с Se в различных концентрациях. Из рис. 3 видно, что в обоих случаях наиболее интенсивным из дисульфидов является ион с m/z 427.24, соответствующий смешанному дисульфиду SG-Cys. Кроме того, на масс-спектрах присутствуют ионы, соответствующие Cys-Cys и GS-SG. В обоих спектрах также регистрируется Se-дисульфиды GS-Se-SG и GS-Se-Cys в виде одно- и двухзарядных ионов и "следы" иона Se-дисульфид-цистеина (Cys-Se-Cys) даже в смеси с наибольшей концентрацией Se.

При хроматографии смесей SeIV с GSH и Cys (рис. 4) регистрируются только продукты, содержащие глутатион, поскольку как сам цистеин, так и его окисленная форма спектрофотометрически не детектируются. Наличие продуктов в хроматографических пиках, указаных на этих рисунках, подтверждено масс-спектрометрически. Отметим, что в пиках, подходящих для количественного анализа, не зарегистрирован продукт SG-Cys, однако его концентрация может быть рассчитана из баланса по GSH.

Рис. 4. Хроматограммы реакционных смесей, полученных при взаимодействии Se^IV с GSH и Cys при эквимолярном соотношении концентраций Se^IV и сульфгидрильных соединений 1:1:1 (а) и при концентрации Se, в 2 раза уменьшенной — 1: 2 : 2 (б)

Табл. 3. Распределение продуктов реакции Cys, GSH и Se в водных смесях при различных соотношениях реагентов

№ п/п	Исходные реагенты, мM			Состав продуктов, содержащих глутатион, %
	Se	GSH	Cys	GSSG	GS-Cys	GSSeSG	GS-Se-Cys
1	3.33	3.33	3.33	2.0	14.3	37.9	45.8
2	1.66	3.33	3.33	2.5	31.4	31.8	34.3
3	0.83	3.33	3.33	32.0	28.5	16.4	23.1
4	0.33	3.33	3.33	5.1	68.6	16.6	9.8

С учетом вышеупомянутого из хроматографических данных было рассчитано содержание продуктов, содержащих GSH (табл. 3). Из представленных в таблице данных следует:

• •    содержание Se-дисульфидов с GSH (GS-Se-SG и GS-Se-Cys) сопоставимо между собой, но выше, чем соответствующих дисульфидов (GS-SG и GS-Cys);

• •    концентрация GS-Cys существенно превышает концентрацию GS-SG;

• •    соотношение концентраций обоих типов дисульфидов и Se-дисульфидов выравнивается при уменьшении концентрации в среде.

Для интерпретации полученного набора несимметричных продуктов, образующихся при одновременном взаимодействии с Se, были проведены специальные эксперименты для оценки возможности последующих превращений симметричных продуктов реакции с участием исходных сульфгидрильных соединений. Для этого первоначально была осуществлена реакция GSH c SeIV до полного превращения GSH в смесь окисленного глутатиона и его Se-дисульфида (рис. 5, а). Далее к реакционной среде, содержащей только продукты GS-SG и GS-Se-SG добавлялись в эквимолярных количествах либо GSH, либо Cys, либо их смесь в равных соотношениях. Хроматографический анализ полученных реакционных смесей после 2.5 ч инкубации представлен на рис. 5 (концентрации исходных реагентов и концентрации дополнительно вносимых в реакционную смесь сульфгидрильных соединений приведены в разделе "Материалы и методы").

Анализируя полученные результаты, представленные на рис. 5, можно отметить, что введение дополнительной порции GSH привело к дополнительному образованию GS-SG и GS-Se-SG (б), что указывает на достаточное количество SeO 2 в реакционной среде. Аналогичным образом продолжается реакция и при дополнительном введении смеси GSH и Cys (в). Однако при внесении одного Cys в реакционную среду в отсутствие GSH наблюдается исчезновение GS-Se-SG (10.1 мМ), и при этом образуется эквивалентное количество смешанного Se-дисульфида — GS-Se-Cys (9.5 мМ).

Таким образом, представленные выше эксперименты подтверждают наличие обменных процессов с участием Se-дисульфидов при наличии соединений со свободными сульфгидрильными группами со скоростями, сопоставимыми с образованием основных продуктов. При этом в процессе замещения

Рис. 5. Хроматограммы реакционных смесей до (а) и после дополнительного введения в реакционную среду GSH (б), Cys (в) и их смеси (г)

Рис. 6. Хроматограммы реакционных смесей при одновременном добавлении AgNO₃ и Se к GSH (а) и при добавлении AgNO₃ после взаимодействия GSH с Se

в симметричном Se-дисульфиде GS на Cys свободный GSH не регистрируется, поскольку он вступал бы в реакцию с SeO 2 с образованием тех же самых продуктов, которые имелись в реакционной среде до внесения Cys. В конечном итоге система через 2.5 ч приходит к некоторому равновесию, которое представлено набором продуктов, обозначенных на рис. 5, г.

Конкурентное взаимодействие сульфгидрильных групп глутатиона с селеном и ионами серебра

Как уже отмечалось выше, ряд биологически активных соединений и в том числе глутатион принимают активное участие в дезинтоксикациии, вызванной присутствием ионов тяжелых металлов. Такое действие может быть обусловлено взаимодействием с металлами сульфгидрильных групп GSH. Можно предположить, что и другие компоненты биологических сред, в том числе и селен, могут корректировать этот процесс. В связи с этим нами были проведены эксперименты по выяснению влияния ионов металлов на взаимодействие глутатиона с селеном на примере ионов серебра.

Эксперименты проводились следующим образом: в раствор со смесью селена и азотнокислого серебра добавлялся GSH. Далее реакционная смесь анализировалась с помощью ВЭЖХ по методике, описанной в предыдущем разделе. На рис. 6 представлены результаты хроматографии исследованных смесей; анализа хроматограмм — в табл. 4.

В экспериментах контролировалось образование двух продуктов: GS-SG и GS-Se-SG. Отметим, что ни хроматографически, ни масс-спектрометрически продукты GSH с ионами серебра не регистрируются, поскольку образование данного продукта приводит к потере растворимости GS-Ag.

Вместе с тем, как следует из результатов, представленных в табл. 4, при одновременном введении ионов серебра с продуктами реакции пропорционально уменьшается количество двух продуктов GS-SG и GS-Se-SG.

Введение ионов серебра после взаимодействия GSH с селеном не изменяет концентрации продуктов GS-SG и GS-Se-SG. Также было обнаружено, что ионы серебра не взаимодействуют с Se-дисульфидами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проделанные эксперименты свидетельствуют о том, что даже неферментативные реакции селена с глутатионом и цистеином представляют собой совокупность сложных процессов, приводящих к образованию набора продуктов, которые продолжают претерпевать изменения при изменении состава реакционной среды. Этим и обусловливается регуляция различных процессов, протекающих с участием GSH и Se

Табл. 4. Состав реакционных смесей после дополнительного введения азотнокислого серебра в концентрациях от 0 до 33 мM в реакционную среду, состоящую из 33 мM глутатиона и 33 мM селена

№ п/п	AgNO3, мM	GS-SG и GS-Se-SG		GS-Ag, мМ
		мМ	%
1	0	0.333	100	0
2	0.0165	0.32	96	0.013
3	0.0494	0.28	84	0.053
4	0.0825	0.25	76	0.083
5	0.165	0.08	23	0.253
6	0.333	0	0	0.333
7	0.333*	0.333	100	0

Примечание. * — в течение 30 мин проведена прединкубация GSH c Se перед добавлением азотнокислого серебра.

в биологических средах, в которых активно участвует и ряд ферментов [4–6]. Отметим, что реальные биологические среды являются более многокомпонентными по набору соединений с сульфгидрильными группами. Они представлены как в белках и пептидах, так и в виде низкомолекулярных соединений, таких как гомоцистин, концентрация которого при ряде патологий существенно превосходит концентрацию GSH [7].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы вещества: глутатион восстановленный; глутатион окисленный; L-цистеин 99 % (Sigma); диоксид селена (ООО Вектон); муравьиная кислота (Merck); ацетонитрил (НПК Криохром).

Экспериментальные работы по разработке методики исследования влияния ионов тяжелых металлов и селена на биологические объекты проводились на приборе МХ-5310, оборудованном электрораспылительным источникам ионов (electrospray ionization, ESI) и времяпролетным масс-анализатором (TOF) с ортогональным вводом ионов, разработанным в Лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии ИАнП РАН. Все спектры получены в режиме детектирования положительных ионов.

Хроматографию проводили на микроколоноч-ном жидкостном хроматографе Милихром А02 (Эконова, Новосибирск). Хроматографическая колонка размером 2 × 75 мм заполнена сорбентом Prontosil 120-5С18AQ (Bischoff, Германия). Элюцию осуществляли градиентом концентрации аце- тонитрила от 2 до 90 % (по объему) в растворе 0.25 % муравьиной кислоты со скоростью 100– 150 мкл/мин. При проведении анализа объем анализируемой пробы составлял 10 мкл, скорость подачи раствора образца — 2 мкл/мин. Площади пиков вычисляли, учитывая, что коэффициент молярной экстинкции глутатиона равен 1.5∙107.