Исследование однонуклеотидных полиморфизмов генов Rho-сигнального пути у людей, подвергавшихся хроническому профессиональному внешнему облучению

Белки Rho-сигнального пути являются частью MAPK (группа мультифункциональных внутриклеточных сигнальных путей) и играют ключевую роль в передаче сигналов из внеклеточной среды внутрь клеток для поддержания гомеостаза [1]. Эти белки у эукариот контролируют основные клеточные процессы, включая морфогенез, подвижность, поляризацию, реорганизацию цитоскелета, клеточное деление и экспрессию генов [2].

Анализ научных публикаций показывает рост интереса к генам Rho-сигнального пути, т.к. они важны для прогнозирования течения злокачественных новообразований и метастазирования. Их экспрессия повышена в некоторых опухолевых клетках и связана с подавлением апоптоза и увеличением клеточной подвижности [3]. Обзор научной литературы показал, что

Исубакова Д.С.* – науч. сотр.; Кирейкова А.В. – мл. науч. сотр.; Цыпленкова М.Ю. – мл. науч. сотр.; Цымбал О.С. – науч. сотр.; Вишневская Т.В. – мл. науч. сотр.; Мильто И.В. – зам. директора, д.б.н., доцент; Тахауов Р.М. – директор, д.м.н., проф.. ФГБУН СБН Центр ФМБА России. Литвяков Н.В. – зав. лаб., д.б.н. НИИ онкологии Томского НИМЦ.

Rho-сигнальный путь участвует в процессах клеточного ответа на ионизирующее излучение (ИИ), однако точный механизм этого участия до сих пор не выяснен [4]. Белки Rho-сигнального пути, функционирующие как молекулярные переключатели, играют важную роль в регуляции клеточных процессов, что позволяет предположить их потенциальную связь с ответом клеток на радиационный стресс [5].

Радиационное воздействие выступает мощным стрессовым фактором для клеточных структур, инициируя сложные каскады клеточных и молекулярных реакций [6]. В условиях современного технологического прогресса, где ИИ широко используется в различных сферах промышленности и медицины [7], изучение механизмов, определяющих радиочувствительность клеток, приобретает особую значимость. Это обусловлено необходимостью повышения эффективности радиационной защиты и разработки инновационных терапевтических подходов, основанных на использовании ИИ.

В свете вышеизложенного, идентификация и исследование генов, определяющих повышенный уровень индивидуальной радиочувствительности организма человека, важны для прогнозирования последствий воздействия ИИ. Комплексный подход к изучению этих генов позволит выявить ключевые молекулярные механизмы, ответственные за вариабельность индивидуальной реакции организма человека на действие ИИ, и, как следствие, разработать персонализированные методы профилактики и лечения радиационных поражений.

Цель исследования – установление ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов Rho-сигнального пути с повышенной частотой хромосомных аберраций (ХА) у работников объекта использования атомной энергии (ОИАЭ) под действием длительного техногенного профессионального облучения ИИ низкой интенсивности.

Материал и методы

Для исследования сформированы две группы: группа контроля – 72 условно здоровых работника ОИАЭ, не подвергавшихся в процессе профессиональной деятельности облучению ИИ, и группа исследования, состоящая из 100 условно здоровых работников ОИАЭ, подвергавшихся в ходе профессиональной деятельности долговременному внешнему облучению ИИ (γ-излучение) в диапазоне доз 100-500 мЗв. Диапазон доз от 100 до 500 мЗв определён нами в результате предварительных исследований в связи с тем, что в данном дозовом диапазоне зависимость «доза-эффект» не приводит к изменению частоты ХА [8]. Характеристика работников ОИАЭ представлена в табл. 1.

Характеристика работников ОИАЭ, включённых в исследование

Таблица 1

Показатель	Группа контроля		Группа исследования
Количество Мужчины/женщины Количественные характеристики Возраст, лет Стаж работы, лет Доза облучения (γ-излучение), мЗв	72 38/34		100 100/0
	Медиана	Q1-Q3	Медиана	Q1-Q3
	58,00 24,00 –	49,50-68,50 12,00-33,00 –	64,00 33,00 181,50	54,00-71,00 29,00-42,00 151,22-289,36

Примечание: Q1-Q3 – интерквартильный размах.

Все доноры подписали информированное добровольное согласие. Сбор и уточнение информации о донорах биологического материала реализованы с применением базы данных регионального медико-дозиметрического регистра персонала ОИАЭ [9]. Лицам, включённым в исследование, проводили цитогенетический анализ лимфоцитов крови [8].

ДНК работников ОИАЭ выделяли из лейкоцитов крови с использованием набора QIAamp DNA Blood mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Чистоту (А260/А280=1,80-2,00, А260/А230=1,90-2,15) и концентрацию (50-150 нг/мкл) выделенной ДНК устанавливали на спектрофотометре EzDrop-1000 (BlueRay Biotech, Тайвань).

Подбор генов-кандидатов для исследования осуществляли по итогам широкогеномного анализа с использованием ДНК-чипов CytoScan™ HD Array (Affymetrix, США). Пробоподготовку, гибридизацию и сканирование осуществляли в соответствии с протоколом фирмы-производителя ДНК-чипов. Обработку результатов широкогеномного анализа выполняли с применением программы Chromosome Analysis Suite 4.3 (Affymetrix, США). В результате анализа была составлена база данных генотипов в формате Excel (346 Мб), содержащая 750000 ОНП 12000 генов и некоторых межгенных участков. Из данной базы генотипов были отобраны и изучены 5773 ОНП 168 генов Rho-сигнального пути ( ABL1, ABL2, AKAP13, ARAP1, ARAP2, ARFGAP1, MIR4326, ARFGAP3, ARHGAP1, ARHGAP10, ARHGAP11A, SCG5, ARHGAP11A-SCG5, SCG5-AS1, ARHGAP12, ARHGAP15, ARHGAP17, ARHGAP18, ARHGAP19, ARHGAP19-SLIT1, ARHGAP20, ARHGAP21, ARHGAP22, ARHGAP23, ARHGAP24, ARHGAP25, ARHGAP26, ARHGAP27, ARHGAP28, ARHGAP29, ARHGAP30, ARHGAP31, ARHGAP32, ARHGAP33, ARHGAP35, ARHGAP39, ARHGAP4, ARHGAP40, ARHGAP42, ARHGAP44, ARHGAP45, ARHGAP5, ARHGAP6, ARHGAP8, PRR5-ARHGAP8, ARHGDIB, ARHGEF1, ARHGEF10, ARHGEF10L, ARHGEF11, ARHGEF12, ARHGEF15, ARHGEF16, ARHGEF17, ARHGEF18, ARHGEF19, ARHGEF2, ARHGEF25, ARHGEF26, ARHGEF28, ARHGEF3, ARHGEF33, ARHGEF37, ARHGEF38, ARHGEF39, CCDC107, ARHGEF4, ARHGEF40, ARHGEF6, ARHGEF7, ARHGEF9, ASPHD1, KCTD13, BCR, BRK1, BTK, CDC20, CDC25C, CDC42, CDC42BPB, CDC42EP1, CDC42EP2, CDC42EP3, CDC42EP4, CDC42SE2, DAAM1, DAAM2, DEF6, DEPDC1B, DLC1, DOCK2, ECT2, EPSTI1, ERBIN, FAM13A, FAM13B, FERMT2, GARRE1, GOLGA1, KDM4C, LPAR2, GMIP, MCF2L, NET1, PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6, BUB1B-PAK6, PARD6B, PLEKHG1, PLEKHG2, PLIN3, PLK1, PREX1, PREX2, RAB7A, RAB9A, RAB9B, RAC1, RAC2, RACGAP1, RANBP2, RAPGEF1, RASAL2, RASGRF2, RASGRF2-AS1, RCC2, RHOA, RHOB, RHOBTB1, RHOBTB2, RHOBTB3, RHOC, RHOD, RHOF, RHOG, RHOH, RHOJ, RHOQ, RHOT1, RHOU,RHPN2, RND3, RNF20, ROCK1, ROCK2, RRAS2, RTKN, SCAI, SH3RF1, SOS1, SOS2, SRGAP1, STARD13, STARD8, SYDE2, TAGAP, TAGAP-AS1, TIAM1, TRIO, UBXN11, VAV1, VAV2, VAV3, VCP ). Для идентификации ОНП и генов, к которым они принадлежат, в исследовании применяли базы данных GWAS Catalog, NCBI, SNPedia, OMIM.

Для каждого ОНП был проведён анализ данных по лог-линейной регрессии (для признаков с непрерывной изменчивостью) для всех четырёх генотипических моделей (кодоминантной, доминантной, рецессивной и сверхдоминантной) в программе RStudio version 2024.12.0+467 с использованием языка программирования R. Рецессивная генотипическая модель выбрана согласно информационному критерию Акаике. В соответствии с рецессивной моделью были выявлены различия в частоте ХА между людьми, которые являются гомозиготными по доминантному аллелю или гетерозиготными носителями, с одной стороны, и теми, кто гомозиготен по рецессивному аллелю, с другой.

Математическую обработку количественных данных выполняли с использованием программы Statistica 13.5.0.17 (StatSoft, США). С помощью программы Court lab HW calculator в выборке определяли соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга. Для оценки различий по частоте ХА применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми различия считали при p<0,05. Для коррекции уровней доверительного интервала при множественных сравнениях использовали поправку Бонферрони (p=0,00002).

Результаты и обсуждение

В рамках данного исследования был проведён сравнительный цитогенетический анализ, направленный на выявление различий в частоте ХА между группой контроля, состоящей из 72 работников ОИАЭ, не подвергавшихся хроническому техногенному облучению, и группой исследования, в которую были включены 100 работников, подвергавшихся хроническому техногенному воздействию ИИ в ходе профессиональной деятельности. Результаты цитогенетического исследования представлены в табл. 2.

Сравнение частоты и спектра ХА у работников ОИАЭ группы контроля и группы исследования

Таблица 2

Тип ХА	Частота ХА на 100 клеток Me (Q1-Q3)		p
	группа контроля, n=72	группа исследования, n=100
Аберрантные клетки	1,4863 (0,6407-2,7573)	2,6666 (1,6666-3,6666)	0,0000
Хроматидные фрагменты	0,3333 (0,0000-0,9569)	0,6666 (0,2619-1,3331)	0,0516
Хромосомные фрагменты	0,3333 (0,0000-0,6666)	0,3333 (0,0000-1,0000)	0,1950
Кольцевые хромосомы	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,3333)	0,0016
Дицентрические хромосомы	0,3333 (0,0000-0,9868)	0,7189 (0,0000-1,5130)	0,0043
МАК	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,9851
Хроматидные обмены	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,3814
Транслокации	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,2310
Полиплоидные клетки	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,5763

Примечание: МАК – мультиаберрантные клетки; Me – медиана; Q1-Q3 – интерквартильный размах; n – количество обследованных работников ОИАЭ; при p<0,05, рассчитанном по критерию Манна-Уитни, различия считали статистически значимыми.

В соответствии с табл. 2 частоты большей части типов ХА, не являющиеся маркерами радиационного воздействия, в группе контроля и группе исследования не отличаются. По причине того, что большинство обследованных работников ОИАЭ проживают и работают в схожих условиях, а группа контроля и группа исследования, на которой была изучена ассоциация высокой частоты ХА с ОНП, не различаются существенным образом, за исключением маркеров радиационного воздействия – кольцевых и дицентрических хромосом. Вероятно, существенный вклад в увеличение частоты ХА у человека может вносить образ жизни: курение, употребление алкоголя и др. [10, 11]. Однако, частота маркеров радиационного воздействия, а также частота аберрантных клеток (из-за кольцевых и дицентрических хромосом) статистически выше у работников ОИАЭ, подвергавшихся в процессе своей профессиональной деятельности долговременному облучению ИИ, что потенциально говорит о синергетическом действии различных генотоксических факторов. При этом наблюдается превалирующее значение факторов физической природы, в частности, ИИ, которые и вызывают появление ХА хромосомного типа [12, 13]. Данное наблюдение свидетельствует о корректности подбора исследуемой выборки, что позволяет проводить углублённый анализ для группы исследования.

На следующем этапе исследования проведён микроматричный анализ. В результате широкогеномного исследования для каждого из 100 работников ОИАЭ установлены генотипы

(гомозиготный рецессивный, гомозиготный доминантный или гетерозиготный) по 750000 ОНП, из которых отобраны 5773 ОНП 156 генов Rho-сигнального пути.

Проанализировано распределение генотипов по выбранным 5773 ОНП. Результаты показали соответствие ожидаемому распределению согласно равновесию Харди-Вайнберга для 4529 ОНП. Для устранения влияния незначительного числа участников из анализа исключены все однотипные ОНП и ОНП, которые имеют менее пяти аллелей каждого из трёх типов: гомозигота по минорному аллелю, гетерозигота и гомозигота по мажорному аллелю. В итоге из 4529 ОНП осталось 2129 ОНП, для которых проанализирована связь с повышенной частотой ХА у 100 работников ОИАЭ, имеющих дозу внешнего облучения в диапазоне 100-500 мЗв.

На рис. 1 приведены уровни логарифмической значимости для 2129 ОНП по дицентричес-ким хромосомам, на рис. 2 – по кольцевым хромосомам. По оси Y отложен отрицательный десятичный логарифм уровня значимости. Пунктирная линия демонстрирует уровень значимости, рассчитанный по критерию Манна-Уитни, равный -lg(0,05)=1,3010, сплошной горизонтальной линией показан уровень значимости с учётом поправки Бонферрони, равный -lg(0,05/2129)=4,6292.

В результате после внесения поправки Бонферрони статистически значимой ассоциации между 2129 ОНП генов Rho-сигнального пути и всеми изученными типами ХА не выявлено. Однако обнаружена связь на уровне тенденции для ОНП rs6801499 гена ARHGEF3 с повышенной частотой кольцевых хромосом (рис. 2). Вследствие этого проведено в рамках рецессивной модели сравнение полученных результатов генотипирования с частотой и спектром ХА в лимфоцитах крови для rs6801499 . Исследование показало, что минорный аллель rs6801499 ассоциирован с увеличением числа кольцевых хромосом. В отношении других типов ХА значимых различий не обнаружено (табл. 3).

Рис. 1. Уровни значимости отрицательного десятичного логарифма для рецессивной модели по частоте дицентрических хромосом.

Таблица 3

Частота ХА по генотипам	ARHGEF3 rs6801499		р
	G/G+G/A, n=93	A/A, n=17
Аберрантные клетки	2,5714 (1,6666-3,6544)	3,0000 (2,3333-4,0000)	0,1505
Хроматидные фрагменты	0,6666 (0,2857-1,3330)	0,6269 (0,0000-1,5723)	0,8718
Хромосомные фрагменты	0,3333 (0,0000-1,0000)	0,3333 (0,0000-1,3333)	0,7398
Кольцевые хромосомы	0,0000 (0,0000-0,3246)	0,3333 (0,3225-0,6666)	0,00009
Дицентрические хромосомы	0,7712 (0,0000-1,5974)	0,6666 (0,0000-1,2578)	0,9659
МАК	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,7469
Хроматидные обмены	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,5249
Транслокации	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,8718
Полиплоидные клетки	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,0000 (0,0000-0,0000)	0,9394

Рис. 2. Уровни значимости отрицательного десятичного логарифма для рецессивной модели по частоте кольцевых хромосом.

Частота ХА (на 100 клеток, Me (Q1-Q3)) в зависимости от генотипов по изученным генам у работников ОИАЭ

Примечание: МАК – мультиаберрантные клетки; Me – медиана; Q1-Q3 – интерквартильный размах; n – число обследованных с данным генотипом в группе; при p<0,05, с поправкой Бонферрони р=0,000023.

Несмотря на то, что в ходе настоящего исследования не удалось выявить статистически значимой корреляции между ОНП генов Rho-сигнального пути и повышенной частотой ХА, полученные данные свидетельствуют о потенциальной роли этих генетических вариаций в модуляции уровня индивидуальной радиочувствительности организма человека. Дальнейшие исследования в этой области помогут установить молекулярные механизмы, лежащие в основе повышенного уровня индивидуальной радиочувствительности организма человека, и способствовать разработке персонализированных подходов к лучевой терапии.

В нашем исследовании ген ARHGEF3 представляет собой наиболее многообещающий маркер для дальнейшего изучения. ARHGEF3 расположен на хромосоме 3p14.3 и кодирует белок, принадлежащий семейству Rho GEF, обнаруживаемый в тромбоцитах, лейкоцитах и нейронах [14]. Он играет важную роль в модуляции активности для ГТФаз RhoA и RhoB [15].

ARHGEF3 интенсивно исследуется в контексте широкого спектра заболеваний и клеточных процессов, что свидетельствует о его значительной роли в развитии заболеваний (например, злокачественных новообразований) и контроле функций клеток [16, 17]. Что касается роли этого гена при злокачественных новообразованиях, выявлено его участие в регуляции дифференцировки клеток при остром миелоидном лейкозе [18]. ARHGEF3 может служить индикатором для прогнозирования и потенциальной мишенью для лечения злокачественных новообразований носоглотки и при остеосаркоме [19, 20]. Результаты исследования Zhou F. и соавт. демонстрируют высокую экспрессию гена ARHGEF3 , который играет ключевую роль в патогенезе немелкоклеточного рака лёгкого [21].

Таким образом, ARHGEF3 является перспективным геном для дальнейших исследований, направленных на установление молекулярных механизмов, лежащих в основе различных заболеваний. Изучение функций этого гена и его взаимодействий с другими компонентами сигнальных каскадов может открыть новые перспективы для разработки эффективных терапевтических стратегий, направленных на коррекцию дисрегуляции клеточной сигнализации и профилактику развития патологических состояний.

Заключение

В результате исследования не выявлено статистически значимой ассоциации между 5773 ОНП генов Rho-сигнального пути и повышенной частотой изученных типов ХА. Обнаружена связь на уровне тенденции для ОНП rs6801499 гена ARHGEF3 с повышенной частотой кольцевых хромосом.

Несмотря на отсутствие ассоциации между ОНП генов Rho-сигнального пути и повышенной частотой ХА, результаты исследования указывают на вовлечённость этих генов в формирование повышенного уровня индивидуальной радиочувствительности организма человека. Поскольку исследование проведено на основе базы данных, полученных с помощью микроматричного анализа, для подтверждения выводов необходимы дальнейшие исследования на выборке большего объёма с привлечением дополнительных молекулярно-генетических методов.