Исследование полиморфизмов генов UGT1A1 и DPYD у пациентов с колоректальным раком

Персонализированный подход к лечению онкологических больных предполагает индивидуализированный подбор схем лекарственной терапии и дозировки препаратов, которые должны учитывать генетические особенности каждого пациента. Фармако-генетическое тестирование, предваряющее назначение лекарственных средств, широко включено в рекомендации международных и национальных профессиональных научных организаций [1, 2].

Изоформа 1 фермента уридиндифосфат глю-куронозилтрансферазы (UGT1A1) играет ис- ключительную роль в метаболизме билирубина, эндогенных гормонов и многочисленных фармакологических соединений, включая иринотекан. Описано несколько полиморфизмов гена UGT1A1, которые приводят к снижению активности соответствующего фермента. Наиболее хорошо охарактеризованы аллель *28, представляющий собой амплификацию динуклиотидных повторов ТА в промоторе, и аллель *6 SNP, приводящий к значимой аминокислотной замене (Gly71Arg). Особо выделяют гомозиготное состояние аллеля *28, которое является основной причиной развития наследственного синдрома Жильбера [9]. В случае химиотерапии иринотеканом у носителей упомянутых полиморфизмов чрезмерно накапливается активный метаболит (SN-38) и развиваются тяжелые токсические реакции.

Выявленные и описанные различия в эффективности лекарств и токсичности их терапевтических доз в зависимости от генотипа пациента привели к пониманию необходимости генетического тестирования, предваряющего химиотерапию на основе фторпиримидинов и иринотекана, для уменьшения риска опасных для жизни побочных эффектов.

Цель исследования состояла в оценке частоты полиморфизмов *6, *28 гена UGT1A1 и *2А гена DPYD в группе пациентов с диагностированным колоректальным раком (КРР), получавших химиотерапию с 5-фторурацилом и/или иринотеканом, и в сопоставлении результатов генотипирования с развитием побочных токсических реакций.

Материал и методы

Молекулярно-генетическое исследование полиморфизмов *6 (rs4148323, 211G>A) и *28 (rs8175347, ТA6>ТА7) гена UGT1A1 и *2А (rs3918290, 735G>A) гена DPYD было проведено у 94 пациентов с II–IV стадиями колоректального рака (табл. 1). В иссле- таблица 1

клинико-морфологическая характеристика пациентов

Характеристика Количество больных T3N0M0 22 (23 %) Стадия опухоли T3–4N1M0 38 (40 %) T3–4N1–2M1 35(37 %) Гистологический тип опухоли Аденокарцинома 92 (98 %) Плоскоклеточный рак 2 (2 %) Степень дифференцировки опухоли G2 55 (58,5 %) G3 39 (41,5 %) Пол Женщины 48 (51 %) Мужчины 46 (49 %) <45 13 (14 %) Возраст, лет 45–65 50 (53 %) >65 31 (33 %) дуемую группу вошли пациенты европеоидного типа в возрасте от 34 до 80 лет; медиана возраста больных составила 61 год. Среди гистологических типов опухолей были идентифицированы аденокарциномы G2 и G3 (98 %) и плоскоклеточный рак (2 %). Преобладали опухоли с локализацией в дистальном отделе толстой кишки (85 %). Каждый пациент подписал добровольное информированное согласие на участие в проведении исследования.

Для исследования использовали венозную кровь, отобранную в вакуумные пробирки Green-Vac-Tube (Корея) с ЭДТА-К2. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора «ДНК-сорб В» («АмплиСенс», Россия), согласно протоколу производителя.

Идентификацию аллелей *6 и *28 UGT1A1 проводили с помощью комплекта реагентов UGT1A1 -Pyro kit (Qiagen, Germany), согласно протоколу производителя путем пиросеквенирования полученного ПЦР-продукта в системе генетического анализа PyroMarkQ24 (Qiagen, Germany). Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения PyroMark Q24 Software (Qiagen, Germany).

Для выявления мутации 735G>A в гене DPYD использовали набор реагентов Real-time-PCR DPYD-G735A (Биолинк, Новосибирск), согласно протоколу производителя. Аллель-специфичную ПЦР в режиме реального времени проводили на амплификаторе «CFX96» (Bio-Rad, США).

Данные, полученные в ходе проведения 165 курсов химиотерапии, были проанализированы на наличие токсических эффектов, согласно критериям оценки степени тяжести нежелательных явлений (СТСАЕ 3.0).

Статистическую оценку достоверности различий проводили с использованием критерия χ2 в пакете программ SSPS Statistics v.19. Отклонение частот генотипов от равновесия Харди–Вайнберга было оценено с использова- нием онлайн-калькулятора HWE Test Michael H. Court (20052008) на базе Excel (http: // edu/~mcourt01/Documents/Court%20lab% 20%20 .

Результаты

В рамках данного исследования подавляющее большинство пациентов (87 человек) получали химиотерапевтическое лечение с 5-фторурацилом. В выборке не выявлено случаев SNP-мутации 735G >A в гене DPYD. Однако развитие гастроинтестинальных токсических реакций наблюдали в 24 % случаев. Клинически значимая гематологическая токсичность была представлена в основном нейтропенией II–III-й степени (у 7 % пациентов). Отмечена тенденция худшей переносимости 5-ФУ в более молодом возрасте (р=0,060).

При анализе распределения частот генотипов UGT1A1 (табл. 2) было установлено, что наиболее часто встречающимися вариантами являются гетерозиготный по аллелю *28 (ТА6/ТА7) и гомозиготный «дикий» по аллелю *6 (G/G), а наиболее редкими – гомозиготный по *28 (ТА7/ТА7) и гетерозиготный по аллелю *6 (G/A). Носителями дикого гомозиготного генотипа, сочетающего *28 ТА6/ТА6 и *6 G/G, являлись 36 пациентов (40 %). Гомозиготный генотип UGT1A1 *6 A/A не обнаружен. В одном случае было отмечено сочетание мутантных гетерозиготных генотипов ТА6/ТА7 и G/A. В итоге частота аллелей *28 и *6 гена UGT1A1 в исследованной выборке составила 0,346 и 0,016 соответственно. Распределение частот генотипов по изученным аллелям соответствовало равновесию Харди–Вайнберга (χ²=0,025 при р=0,875 для *6 UGT1A1 ; χ²=1,042 при р=0,308 для *28 UGT1A1 ). Связи частоты встречаемости генотипов с возрастом, полом и стадией опухолевого процесса обнаружено не было (табл. 3).

В таблице 2 приведены данные частот генотипов в исследованной выборке и литературные таблица 2 распределение частот аллелей и генотипов по полиморфизмам *6 и *28 гена UGT1A1 в группах разного этнического происхождения

Аллель/генотип	Юг России (n=94)	Нидерланды (n=138) [11]	Узбекистан (n=97) [10]	Япония (n=150) [10]
*6	0,016		0,090	0,170
χ2 (vs Юг России)			9,885 (р=0,002)	35,224 (р<0,001)
*1/*1	0,968 (91 %)		0,850 (82 %)	0,690 (103 %)
*1/*6	0,032 (3 %)		0,013 (13 %)	0,290 (43 %)
*6/*6	0 (0)		0,020 (2 %)	0,030 (4 %)
χ2 (vs Юг России)			8,673 (р=0,014)	28,115 (р<0,001)
*28	0,346	0,304	0,314	0,120
χ2 (vs Юг России)		0,879 (р=0,349)	0,423 (р=0,561)	35,884 (р<0,001)
*1/*1	0,404 (38 %)	0,471 (65 %)	0,467 (45 %)	0,770 (79 %)
*1/*28	0,500 (47 %)	0,449 (62 %)	0,443 (43 %)	0,220 (66 %)
*28/*28	0,096 (9 %)	0,080 (11 %)	0,090 (9 %)	0,010 (5 %)
χ2 (vs Юг России)		1,094 (р=0,597)	0,728 (р=0,698)	6,178 (р-0,046)

Примечание: жирным выделены статистически значимые различия.

таблица 3

распределение частот генотипов (*28 UGT1A1 ) и иринотекан-ассоциированной токсичности в зависимости от клинико-морфологических признаков (пол, возраст, стадия заболевания)

Признак/значи-мость различий *1/*1 Генотип (n=94) *1/*28 *28/*28 Побочные токсические эффекты (n=50) Отсутствуют Присутствуют Стадия I–II (n=20) 7 (7,4 %) 11 (11,7 %) 2 (2,1 %) 2 (4 %) 7 (14 %) III–IV (n=74) 31 (33,0 %) 36 (38,3 %) 7 (7,4 %) 13 (26 %) 28 (56 %) χ2 0,317 при р=0,854 0,316 при р =0,873 Пол Мужчины (n=46) 18 (19,1 %) 25 (26,6 %) 3 (3,2 %) 8 (16 %) 14 (28 %) Женщины (n=48) 19 (20,2 %) 23 (24,5 %) 6 (6,4 %) 7 (14 %) 21 (42 %) χ2 1,068 при р=0,587 0,758 при р=0,385 Возраст <45 (n=14) 5 (5,3 %) 9 (9,6 %) 0 (0 %) 4 (8 %) 8 (16 %) 45–65 (n=50) 19 (20,2 %) 24 (25,5 %) 7 (7,4 %) 6 (12 %) 24 (48 %) >65 (n=30) 14 (14,9 %) 14 (14,9 %) 2 (2,1 %) 5 (10 %) 4 (8 %) χ2 3,745 при р=0,442 4,334 при р =0,115 данные по другим этническим группам, включавшим пациентов с онкопатологией толстой кишки и здоровых доноров. Сопоставление условно здоровых лиц и пациентов с онкопатологией, с нашей точки зрения, возможно в рамках популяционной характеристики герминальных полиморфизмов, не затрагивающих предрасположенность к онкозаболеванию. Согласно приведенным данным, распределение частот аллелей *1, *28 UGT1A1 и соответствующих генотипов значимо различалось в исследованной выборке пациентов по сравнению с выборкой здоровых доноров Японии [10] и не имело различий с донорами из Узбекистана [10] и пациентами с КРР, проживавшими в Нидерландах [11]. Напротив, сравнение частот аллелей *1, *6 и генотипов выявило значимые отличия пациентов Юга России как с выборкой Японии, так и с выборкой Узбекистана (данные по Нидерландам не известны).

На момент исследования для 50 из 94 пациентов с диагностированным колоректальным раком было показано проведение химиотерапии второй линии с иринотеканом. Данные о токсичности проводимой химиотерапии в группах, выделенных по клиническим и генетическим признакам, приведены в табл. 3 и 4. Гематологическая токсичность была представлена преимущественно нейтропенией II–IV степени, кроме того, были отмечены тромбоцитопения II–III степени и анемия II–III степени. Из негематологических осложнений преобладали диарея, тошнота и рвота, отмечены также стоматит, боли в животе, гиперсаливация. В анализ не были включены носители генотипа *6/*1 по причине своей малочисленности. Тем не менее у одного пациента с *6/*1 UGT1A1, получавшего химиотерапевтическое лечение на базе РНИОИ, было отмечено развитие гастроинтестинальных осложнений и нейтропении II степени на иринотекан.

таблица 4

Частота побочных эффектов при химиотерапии иринотеканом в группах с разными генотипами по полиморфизму *28 гена UGT1A1

Побочные токсические эффекты	*1/*1	Генотип, n=50 *1/*28	*28/*28
Отсутствуют	11 (22 %)	9 (18 %)	0 (0 %)
Присутствуют, в т.ч.:	7 (14 %)	27 (54 %)	5 (10 %)
гематологические осложнения	7 (14 %)	13 (26 %)	4 (8 %)
негематологические осложнения	7 (14 %)	14 (28 %)	4 (8 %)
билирубинемия I ст.	1 (2 %)	4 (8 %)	5 (10 %)

Риск развития токсичности не был ассоциирован с возрастом, половой принадлежностью и стадией заболевания (табл. 3). Развитие билируби-немии отмечалось преимущественно у пациентов с синдромом Жильбера (носителей генотипа *28/*28 UGT1A1 ) . Доля гематологических и гастроинтестинальных осложнений повышалась от 39 % случаев в группе с wild-type UGT1A1 до 75 % и 100 % случаев в группах *1/*28 UGT1A1 и *28/*28 UGT1A1 соответственно (табл. 4). В итоге доля пациентов с выраженной токсичностью на проведенную химиотерапию статистически достоверно (χ²=4,217 при р=0,040) была больше в группе носителей *28 полиморфизма по сравнению с wild-type гена UGT1A1 .

Оценка предполагаемой связи между генотипом и развитием нежелательных осложнений на иринотекан продемонстрировала, что шансы развития токсичности у носителей генотипов *28/*28 и *28/*1 в 5 раз выше, чем у носителей wild-type (OR=5,587, CI 95 % 1,679–18,589).

Обсуждение

В ряде современных рекомендаций по химиотерапии опухолевых заболеваний в схемах применения 5-фторурацила и иринотекана содержится информация о предварительном генотипировании пациентов по полиморфизмам генов DPYD и UGT1A1 [1, 2, 12], однако опубликованные исследования весьма противоречивы и часто не учитывают этническую принадлежность различных групп пациентов.

Обширное обсуждение фармакогенетики DPYD выделило одну SNP-мутацию данного гена, 735 G>A, носители которой обладают повышенным риском развития серьезных реакций на лекарственные средства с 5-ФУ [7, 8]. Распространенность таких лиц оценивается в 3–5 %, но значимо варьирует в разных этнических группах [13, 14]. В нашем исследовании у 94 пациентов, проживающих на Юге России, данный полиморфизм не был идентифицирован, что, возможно, связано с популяционными особенностями выборки. Более того, расширение выборки до 245 человек, учитывающее пациенток с диагнозом рак молочной железы и получавших 5-ФУ в схеме химиотерапии, также не позволило выявить SNP 735 G>A (неопубликованные данные). Тем не менее развитие токсичности, связан- ной с 5-ФУ, фиксировалось достаточно часто – у 24 % пациентов. Поэтому изучение расширенного набора клинически значимых полиморфизмов гена DPYD, очевидно, может повысить эффективность прогнозирования как риска развития токсичности, так и её степени [15].

Другой препарат, часто используемый в терапии колоректального рака, – иринотекан, имеет очень узкий терапевтический диапазон, и лечение им может привести к развитию достаточно серьезных побочных эффектов. Так, примерно у 7 % пациентов в ходе лечения иринотеканом обнаруживают тяжелую фебрильную нейтропению и лихорадку, что в итоге приводит к смерти от осложнений [16]. Выявленный высокий полиморфизм гена UGT1A1 предполагает, что некоторые аллели могут оказывать значительное влияние на метаболизм и токсичность иринотекана. Аллель UGT1A1 *28 – наиболее хорошо охарактеризованный в литературе вариант. В популяционном исследовании Chen et al. (2014) [17], включавшем шесть публикаций, не было обнаружено статистически значимой связи между полиморфизмом UGT1A1 *28 и нейтропенией у азиатов. В более масштабном исследовании, авторы которого проанализировали 58 публикаций, были проведены стратифицированные анализы на основе этнической принадлежности, дизайна исследования и типа рака [18]. В итоге статистическая связь между полиморфизмом UGT1A1 *28 и диареей была подтверждена у пациентов из разных популяций Азии с метастазирующим КРР в рамках пяти моделей. Liu et al. [19] провели метаанализ 16 статей и обнаружили, что у пациентов европеоидного типа, несущих генотип *28/*28, был более высокий риск нейтропении и диареи. Однако не было установлено никакой корреляции между полиморфизмом *28 UGT1A1 и нейтропенией, по данным Ferraldeschi et al. [20] и Hyratа et al. [21].

Ранее нами была показана тенденция влияния генотипа по UGT1A1 с дозолимитирующими осложнениями, как гематологическими, так и гастроинтестинальными, у пациентов с КРР (n=38), которым проводилась химиотерапия по схеме FOLFIRI [22]. Увеличение размера выборки в 2,5 раза в целом не повлияло на характер распределения осложнений по группам с разным генотипом. Частота гематологических (нейтропения, тромбоцитопения II–III ст.) и негематологических (рвота, диарея, тошнота) осложнений была выше у пациентов с генотипами *28/*1 и *28/*28. В итоге настоящее исследование показало, что наличие аллеля *28 статистически значимо (р=0,040) влияет на риск развития у пациента выраженной иринотекан-ассоциированной токсичности, повышая его в 5 раз. Кроме того, учитывая связь повышения концентрации билирубинемии с *28/*28 генотипом, молекулярный анализ может помочь скорректировать назначения химиопрепаратов и сопроводительной лекарственной терапии без необходимости биопсии печени пациентам с подтвержденным синдромом Жильбера.

Анализ присутствия полиморфизмов гена UGT1A1 в разных популяциях человека не раз подтверждал связь распределения частоты *28 и *6 аллелей с этнической принадлежностью. Вариант *28 UGT1A1 чаще встречается в европеоидных и африканских популяциях (26–31 % и 42–56 % соответственно), при более низком, но заметном уровне в популяциях Азии (9–16 %) [6, 10, 11]. Аллель *6 UGT1A1 широко представлен в азиат- ском регионе (13–32 %). Полученное нами распределение частот генотипов и аллелей *6 и *28 гена UGT1A1 соответствует более ранним данным пилотного исследования [23] и в целом характерно для европейских популяций, значимо отличаясь от опубликованных данных для Японии, Китая и отчасти Узбекистана (по аллелю *6).