Исследование предшественника препарата, нацеленного на рецептор бомбезина, для пептид-рецепторной радионуклидной терапии

Введение. Рак является одной из основных причин смерти от болезней во всем мире. Согласно оценкам Глобальной онкологической обсерватории (GLOBOCAN) в 2020 г. во всем мире было зарегистрировано около 19,3 млн новых случаев рака и почти 10,0 млн смертей от него. Ожидается, что бремя, связанное с раком, составит 28,4 млн случаев в 2040 г., что на 47 % больше по сравнению с 2020 г. [1].

Долгое время основными методами терапии онкозаболеваний были хирургический, химио- и радиотерапевтический. Однако данные методы, несмотря на широкое распространение, имеют серьезные недостатки: хирургия малоэффективна при метастазирующих типах рака, радио- и химиотерапия не обладают тканеспецифичностью, что приводит к проявлению токсичности по отношению к здоровым тканям и тяжелым побочным эффектам [2].

Прорывом в лечении онкопатологии стала разработка таргетной терапии, которая позволяет оказывать терапевтическое воздействие непосредственно на раковые клетки, не затрагивая здоровые [3]. Частным случаем данной методики является пептид-рецепторная радионуклидная терапия, в которой доставка терапевтической нагрузки (радионуклида) осуществляется с помощью пептидных векторов, способных связываться со специфическими рецепторами на поверхности раковых клеток [4].

Самым крупным классом рецепторов, сверхэкспрессирующих на поверхности раковых клеток, являются рецепторы, связанные с G-белком (GPCR). Этот класс включает более 800 рецепторов, имеющих общую структуру из семи трансмембранных спиралей, которые связаны тремя внутри- и внеклеточными петлевыми областями, внеклеточным N-концом и внутриклеточным карбоксил-концевым доменом [5]. К классу GPCR-рецепторов также относят и семейство бомбе-зиновых рецепторов [6].

Семейство бомбезиновых рецепторов задействовано в самых разнообразных физиологических реакциях, таких как рост тканей, сокращение гладких мышц, пищевое поведение, секреция желез, а также многих эффектах центральной нервной системы, включая регуляцию циркадного ритма [7, 8].

Однако рецепторы бомбезина могут играть важную роль и в развитии онкопатологии [9]. Сверхэкспрессия рецепторов бомбе-зина обнаруживается при таких заболеваниях, как рак молочной железы, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак легких, нейробластомы и др. [10–13]. Рецепторы бомбезина при их сверхэкспрессии оказывают аутокринное действие на рост опухолевой ткани, а также стимулируют ангиогенез [14, 15].

Особенностью, объединяющей семейство рецепторов бомбезина, является их способность взаимодействовать с пептидом под названием бомбезин [16]. Бомбезин был выделен из кожи лягушки Bombina bombina в 1971 г. В. Эрспамером и его коллегами и представляет собой амидированный тетрадекапептид [17]. Именно пептид бомбезин стал основой перспективных пептидных препаратов, использующихся для лечения опухолей, клетки которых экспрессируют рецепторы бомбезина [6].

Перспективность пептидных препаратов обусловлена преимуществами, которыми обладают пептиды. К таковым относят отсутствие иммуногенности, относительно простой и бюджетный синтез, а также относительно простая модификация [18]. Однако пептиды обладают серьезным ограничением – низкая стабильность как in vitro , так и in vivo , особенно пептиды подвержены деградации под действием протеаз крови [19].

Решить проблему стабильности пытаются различными способами: применяя ненатуральные аминокислоты, циклизацию, конъюгацию с различными биополимерами [20]. Одним из перспективных направлений повышения стабильности пептидов стало включение терапевтического пептида в каркас более стабильной пептидной молекулы [21].

Мы разработали новую синтетическую пептидную конструкцию на основе высокостабильного пептида кноттина U5-scytotoxin-Sth1a (UniProt: U51A_SCYTH), выделенного из яда паука Scytodes thoracica , в структуру которого был встроен короткий пептид бомбе-зин (BBN), полученный из кожи лягушки Bombina bombina . Пептид бомбезин был встроен между первым и вторым цистеиновым остатком, что дало структуре название BBN/C1-C2.

Цель исследования . Изучить стабильность структуры BBN/C1-C2, созданной на основе кноттина U5-scytotoxin-Sth1a и пептида бомбезина, тропного бомбезиновыму рецептору, и ее способность связываться с целевыми рецепторами на поверхности раковых клеток.

Материалы и методы . Синтез BBN/C1-C2 осуществляли на пептидном синтезаторе ResPep SL (Intavis, Германия) твердофазным методом с использованием Fmoc-защищенных аминокислот (Intavis, Германия) [22].

В качестве специфического ингибитора использовали тропный бомбезиновому рецептору пептид GRP, синтез которого проводился также твердофазным методом [23].

Контроль результатов синтеза осуществлялся методом обращенно-фазовой хроматографии с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии Shimadzu LC-20AD (Shimadzu, Япония) с применением колонки Dr. Maisch Luna C18(2) по стандартному протоколу градиентного элюирования [24]. По протоколу элюирование осуществлялось парой вода (А) и ацетонитрил (Б), где профиль градиента был: 5 минут 95 % А и 5 % Б, затем в течении 40 мин концентрация элюента А увеличивалась с 5 % до 100 %, в конце анализа происходила регенерация колонки 100 % Б в течение 5 мин. Скорость потока составляла 1 мл/мин, детектирование осуществлялось на длине волны 215 нм.

Также для контроля синтеза использовался масс-спектрометрический анализ с применением комплекса MALDI-TOF MS серии FLEX (Bruker Daltonics, Германия).

По результатам синтеза проводилась очистка пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии с использованием системы AutoPure25-M604 (Inscinstech) и колонки Galaksil EF-C18H (Galak) по стандартному протоколу градиентного элюирования парой «вода-ацетонитрил» [24]. По протоколу элюирование осуществлялось парой вода (А) и ацетонитрил (Б), где профиль градиента был: 20 мин 95 % А и 5 % Б, затем в течении 80 мин концентрация элюента А увеличивалась с 5 % до 100 %, в конце анализа происходила регенерация колонки 100 % Б в течении 40 мин. Скорость потока составляла 5 мл/мин, детектирование осуществлялось на длине волны 215 нм.

Фолдинг пептида проводили в буфере, содержащем 10 мМ восстановленного глутатиона и 1 мМ окисленного глутатиона в 0,1 М трис-HCl, pH 8,0, при 4 °С при осторожном покачивании в течение 24 ч [25].

В качестве флуоресцентной метки для BBN/C1-C2 использовали FAM(6)-NHS («Лю-мипроб», Россия), мечение проводили по стандартному протоколу производителя [26].

Стабильность исследуемого пептида BBN/C1-C2 сравнивали с коммерческим препаратом PSMA-617. PSMA-617 является наи- более современным и перспективным пептидным препаратом, одобренным для таргетной радионуклидной терапии рака предстательной железы, что и обусловило выбор данного препарата для сравнения [27].

Анализ стабильности пептида BBN/C1-C2 и PSMA-617 проводили в физиологическом растворе при 4 °С в течение 96 ч с использованием хроматографической системы Shimadzu LC-20AD XR по принципу обращенно-фазовой хроматографии. Данные обрабатывали в программе Clarity (Clarity Software, Великобритания).

Для анализа прикрепления и интернализации использовали две клеточные культуры: PC-3, экспрессирующую на поверхности бом-безиновый рецептор, и CHO-K1, не экспрессирующую бомбезиновый рецептор [28].

Клетки высеивали в 24-луночные планшеты в концентрации 100 000 на лунку в 1 мл среды. Через 24 ч при достижении экспоненциальной стадии роста вместе со свежей питательной средой добавляли BBN/C1-C2 в 1-, 10-, 100-кратном избытке по массе к GRP и культуру инкубировали 30 мин при 37 °С и 5 % CO2 для ингибирования рецептора бомбе-зина. Затем к культуре добавляли 1 мл среды с GRP и культуру инкубировали 3 ч при 37 °С и 5 % CO2. Через 3 ч среду собирали, а клетки трижды промывали холодным фосфатным буфером для удаления несвязавшихся молекул, добавляли 1 мл глицинового буфера (50 мМ в HCl, pH 2,8) и инкубировали в течение 5 мин. Буфер собирали, ячейки промывали холодным фосфатным буфером. Клетки лизировали в 1 мл 0,3 М NaOH в течение 20 мин и собирали лизат [25]. После этого среду убирали, ячейки промывали холодным фосфатным буфером и делали съемку клеток с использованием оптической системы, включающей микроскоп Nikon Ti-S (Nikon, Япония), камеру DS-Qi1MC, объектив Nikon S Plan Fluor ELWD 20×0.45, соответствующие фильтры и ПК с пакетом NIS-elements 4.0. Количественный анализ изображений выполняли с использованием программного обеспечения Image J. Интенсивность флуоресценции вычисляли по формуле: общая флуоресценция клеток = ин- тегрированная плотность – (площадь выделенной ячейки × средняя флуоресценция фоновых показателей). В качестве контроля фиксировали сигнал флуоресценции без добавления пептидов [29].

Каждый эксперимент проводили в 3 повторах, данные представляли в виде M±SD. Статистическую обработку осуществляли в программе Excel с использованием критерия

Стьюдента, отличия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение. В результате синтеза и хроматографической очистки был получен пептид BBN/C1-C2 с химической чистотой более 90 % (рис. 1А). Также был проведен синтез и хроматографическая очистка пептида GRP, выбранного в качестве специфического ингибитора бомбезинового рецептора (рис. 1Б).

Рис. 1. Хроматограмма пептида BBN/C1-C2 (А) и GRP (Б)

Fig. 1. Chromatogram of BBN/C1-C2 (A) peptide and GRP (B)

В качестве основы для синтетического пептида нами был взят пептид бомбезин, показывающий способность связываться с рецепторами семейства бомбезина, которые экспрессируются на поверхности клеток человека [6]. Такая особенность дает возможность использовать данный пептид как препарат для пептид-рецепторной радионуклидной терапии опухолей, клетки которых сверхэкспрес-сируют рецепторы бомбезина. Однако использование нативного бомбезина ограничивает упомянутая ранее низкая стабильность пептидов in vivo [30]. Работы, ведущиеся в этом направлении, нацелены на модификацию нативной последовательности пептида с сохранением его основного свойства [31].

Нами же был использован иной подход к повышению стабильности пептида бомбе-зина, а именно молекулярная имплантация терапевтического пептида в структуру другого, более стабильного пептида [21]. В качестве такого каркаса был использован пептид кноттин U5-scytotoxin-Sth1a (UniProt: U51A_SCYTH), выделенный из яда паука-птицееда, не проявляющего токсичность в отношении млекопитающих [32].

Кноттины представляют собой особый класс пептидов, особенностью которых является наличие цистиновых (дисульфидных) связей, образующих узловую структуру. Именно это придает кноттинам высокую стабильность в широком диапазоне pH, температур и иных внешних факторов [32]. Различные работы показывают перспективность применения кноттинов в качестве каркаса для терапевтических пептидов. В одном из последних исследований Лей Цзян и соав. разработали и синтезировали гибридный пептид на основе агути-родственного пептида, встроенного в каркас кноттина, – ингибитор трипсина Ecballium elaterium (EETI-II). Разработанный пептид показал высокую аффинность к рецепторам интегрина и высокоспецифичное поглощение целевой опухолью [33].

Пептид бомбезин был встроен между первым и вторым остатком цистеина, что дало получившейся гибридной молекуле название BBN/C1-C2.

Сравнение BBN/C1-C2 и коммерческого препарата PSMA-617 в среде физиологического раствора при температуре 4°С показало, что синтезированный нами пептид BBN/C1-C2 обладает более высокой стабильностью. Так, BBN/C1-C2 и PSMA-617 в течении первых 24 ч сохраняют высокую стабильность, химическая чистота молекул меняется незначительно: химическая чистота PSMA-617 снижается на 5,7 %, тогда как чистота BBN/C1-C2 снижается всего на 0,7 %. Через 96 ч химическая чистота PSMA-617 снижается с 99,7 % до 79,4 %, в то время как чистота BBN/C1-C2 снижается с 96 % до 93,2 % (рис. 2).

Рис. 2. Стабильность пептидов PSMA-617 и BBN/C1-C2 в физиологическом растворе при температуре +4 °С в течении 96 ч (* – достоверное отличие от PSMA-617)

Fig. 2. Stability of PSMA-617 and BBN/C1-C2 peptides in physiological solution, +4°C, 96 hours (* – the difference is significant compared with PSMA-617)

Было проведено исследование конкурентного ингибирования на клеточной культуре, экспрессирующей бомбезиновый рецептор, при совместной инкубации GRP и BBN/C1-C2.

Пептид GRP является аналогом пептида бомбезина, экспрессируется клетками млекопитающих и способен связываться с рецептором GRP, который является членом семейства бомбезиновых рецепторов [34]. Особенностью рецепторов бомбезина также является их минимальная экспрессия на поверхности здоровых клеток млекопитающих (за исключением некоторых органов, например поджелудочной железы) при сверхэкспрессии клетками многих типов рака [35–37].

Для проведения исследования пептиды были помечены флуоресцентной меткой 6-FAM, концентрация BBN/C1-C2 превышала концентрацию GRP в 1, 10 и 100 раз. Результаты исследования показали отсутствие различий GRP и BBN/C1-C2 в соотношении 1:1 в течении 3 ч (рис. 3). При 10-кратном избытке BBN/C1-C2 наблюдалось достоверное снижение сигнала GRP на 30 %. При 100-кратном избытке BBN/C1-C2 не наблюдалось дозозависимого снижения сигнала GRP. Также исследование показало, что избыток BBN/C1-C2 не влияет на интернализацию GRP (рис. 4).

Рис. 3. Доля прикрепленного к мембране GRP при избытке BBN/C1-C2 (* – отличие от контроля)

Fig. 3. Proportion of GRP attached to the membrane with excess BBN/C1-C2 (* – the difference is significant compared with the control)

Рис. 4. Доля интернализованного в клетки GRP при избытке BBN/C1-C2 (* – отличие от контроля)

Fig. 4. Proportion of GRP internalized into cells with excess BBN/C1-C2 (* – the difference is significant compared with the control)

Проведенное исследование показало, что прикрепление и интернализация пептидов GRP и BBN/C1-C2 к клеткам культуры CHO-K1 не превышает значения статистической погрешности (рис. 3 и 4).

Заключение. Таким образом, структура, созданная на основе токсина U5-scytotoxin-

Sth1a с помещенным в положение С1-С2 коротким пептидом, тропным к рецептору бом-безина, сохраняет повышенную стабильность без потери способности связываться с целевым рецептором на поверхности клеток и не затрагивает клетки, не экспрессирующие целевой рецептор.

Данное исследование было профинансировано Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, грант № 123020700216-4 (FEUF-2023-0004).