Исследование предшественника радиофармпрепарата, нацеленного на простат-специфический мембранный антиген

Введение. Рак предстательной железы является одним из наиболее часто диагностируемых онкологических заболеваний во всем мире. Существует несколько основных методов лечения данного заболевания. При первом появлении используются лучевые и хирургические процедуры. Несмотря на значительное увеличение продолжительности жизни после первой хирургической или лучевой терапии, болезнь рецидивирует более чем у 30 % пациентов [1]. Андрогенная депривация чаще всего является альтернативной стратегией лечения рака предстательной железы, поскольку для прогрессирования опухоли необходимы мужские гормоны. Однако, несмотря на отличный первоначальный ответ, у большинства пациентов в течение 2–3 лет возникает рецидив [2]. Химиотерапевтические препараты, такие как доцетаксел, доксорубицин, обеспечивают несколько месяцев выживаемости без прогрессирования, но с высокотоксичными эффектами [3, 4].

Для преодоления ограничений современных методов лечения необходимо разработать такую стратегию лечения, которая позволит избирательно воздействовать на раковые клетки и избегать неблагоприятного влияния на нормальные ткани. Одной из таких стратегий является таргетная терапия с использованием коротких пептидов, нацеленных на специфические рецепторы. Подобные пептиды, меченные радиоизотопами, способны избирательно прикрепляться к рецепторам на поверхности раковых клеток, в т.ч. простат-специфи-ческому мембранному антигену (ПСМА), который в значительной степени экспрессируется на поверхности клеток рака простаты, тем самым оказывая терапевтическое воздействие. К основным преимуществам такого подхода относятся высокая специфичность и сниженная токсичность [5]. Однако здесь также имеется ряд нюансов, в частности низкая стабильность терапевтической молекулы in vivo, что, соответственно, снижает биодоступность [6]. Решить данную проблему можно с использованием пептидов с ингибиторным цистиновым узлом. К данной группе в первую очередь относятся токсины членистоногих, обладающие природной термической и протеолитической стабильностью [7].

В нашей работе мы использовали токсин U5-scytotoxin-Sth1a (UniProt: U51A_SCYTH) паука Scytodes thoracica в качестве стабилизующей молекулы для короткого пептида, тропного к простат-специфическому мембранному антигену. На этой основе был создан пептид PSMA/C1-C2, поскольку короткий пептид помещался между первым и вторым остатками цистеина.

Цель исследования. Изучить стабильность и способность пептида PSMA/C1-C2, созданного на основе кноттина U5-scytotoxin-Sth1a и короткого пептида, тропного к про-стат-специфическому мембранному антигену, связываться с рецепторами на поверхности клеток рака предстательной железы в сравнении с коммерческим препаратом PSMA I&T и специфическим ингибитором.

Материалы и методы.

Синтез PSMA/C1-C2 осуществляли на пептидном синтезаторе ResPep SL (Intavis, Германия) с использованием Fmoc-защищенных аминокислот (Intavis, Германия). Очистку пептида проводили с использованием хроматографической системы NGC Quest™ 10 (Bio-

Rad, США) и сорбента Bio-Gel P-4 на колонке Econo-Column 1×30 cm (Bio-Rad, США). Контроль качества осуществляли с помощью хроматографа Shimadzu LC-20AD XR (Shimadzu, Япония), оснащенного спектрофотометрическим детектором SPD-20A, по принципу обращенно-фазовой хроматографии. Анализ радиохимической чистоты производили на хроматографе Shimadzu (Shimadzu, Япония) с детектором GABI (Elysia-Raytest, Германия). Масс-спектрометрический анализ проводили на основе масс-спектрометрии MALDI-TOF на MALDI-TOF MS серии FLEX (Bruker Daltonics, Германия). Фолдинг пептида проводили в буфере, содержащем 10 мМ восстановленного глутатиона и 1 мМ окисленного глутатиона в 0,1 М трис-HCl, pH 8,0, при 4 °С при осторожном покачивании в течение 24 ч [8].

В качестве питательной среды для клеточных культур применяли RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (Biosera, Франция), витаминов для RPMI-1640, пирувата натрия и пенициллина/стрептомицина. Все компоненты – от «Панэко» (Россия), если не указано иное. Клеточные культуры инкубировали в CO 2 -инкубаторе (Sanyo, Япония) при 37 °С и 5 % CO 2 .

Для анализа прикрепления и интернализации использовали две клеточные культуры: 22Rv1, экспрессирующую на поверхности ПСМА рецепторы, и PC-3, не экспрессирующую ПСМА [10, 11].

Клетки высеивали в 24-луночные планшеты в концентрации 100 000 на лунку в 1 мл среды. Через 24 ч при достижении экспоненциальной стадии роста вместе со свежей питательной средой добавляли PSMA/C1-C2 в 1-, 10-, 100-кратном избытке по массе к PSMA I&T и культуру инкубировали 30 мин при 37 °С и 5 % CO 2 для ингибирования ПСМА. Затем к культуре добавляли 1 мл среды с Lu-PSMA I&T с активностью 2МБк и культуру инкубировали 3 ч при 37 °С и 5 % CO 2 . Через 3 ч среду собирали, а клетки трижды промывали холодным фосфатным буфером для удаления несвязавшихся молекул, добавляли 1 мл глицинового буфера (50 мМ в HCl, pH 2,8) и инкубировали в течение 5 мин. Буфер собирали, ячейки промывали холодным фосфатным буфером. Наконец, клетки лизировали в 1 мл 0,3 М NaOH в течение 20 мин и собирали лизат [12]. После этого активность в среде, глициновом буфере и клеточном лизате измеряли с использованием гамма-счетчика ISOMED 2010 (PTW, Германия).

Для анализа конкурентного ингибирования использовали 2-PMPA. Клетки высеивали в 24-луночный планшет в концентрации 100 000 на лунку и оставляли на 24 ч. После этого к культуре добавляли свежую среду, содержащую 500 мкМ 2-PMPA, и инкубировали 30 мин. Затем среду меняли на свежую с добавлением 1 мкМ FAM-PSMA/C1-C2 и инкубировали еще 3 ч. После этого среду убирали, ячейки промывали холодным фосфатным буфером и делали съемку клеток с использованием оптической системы, включающей микроскоп Nikon Ti-S (Nikon, Япония), камеру

DS-Qi1MC, объектив Nikon S Plan Fluor ELWD 20×0.45, соответствующие фильтры и ПК с пакетом NIS-elements 4.0. Количественный анализ изображений выполняли с использованием программного обеспечения Image J. Интенсивность флуоресценции вычисляли по формуле: общая флуоресценция клеток = интегрированная плотность – (площадь выделенной ячейки × средняя флуоресценция фоновых показателей). В качестве контроля фиксировали сигнал флуоресценции без добавления пептидов [13].

Каждый эксперимент проводили в трех повторах, данные представляли в виде M±SD. Статистическую обработку данных осуществляли в программе Excel с использованием критерия Стьюдента, отличия считали достоверными при p<0,05.

Результаты. В результате твердофазного синтеза был получен пептид PSMA/C1-C2 с чистотой более 90 % (рис. 1Б). Поскольку в основе молекулярной структуры лежит токсин, который формирует три дисульфидных мостика, то в результате фолдинга масса молекулы уменьшилась на 6 дальтон (рис. 1А).

Рис. 1. Масс-спектрограмма (А) и хроматограмма (Б) пептида PSMA/C1-C2

Fig. 1. Mass spectrogram (A) and chromatogram (B) of the PSMA/C1-C2 peptide

Рис. 2. Стабильность пептидов PSMA I&T и PSMA/C1-C2 в физиологическом растворе при температуре 4 °С в течение 96 ч (* – достоверное отличие от группы PSMA I&T)

Fig. 2. Stability of PSMA I&T and PSMA/C1-C2 peptides in saline solution at 4 °С for 96 hours (* – the difference is significant compared with the PSMA I&T group)

Рис. 3. Доля прикрепленного к мембранам и интернализованного в клетки PSMA I&T при избытке PSMA/C1-C2 (* – отличие от контроля)

Fig. 3. Proportion of PSMA I&T attached to membranes and internalized into cells with an excess of PSMA/C1-C2 (* – difference from control)

Аналогичным методом конкурентного ингибирования анализировалось связывание FAM-меченного PSMA/C1-C2 с рецепторами на поверхности раковых клеток 22Rv1 в присутствии в питательной среде специфического ингибитора ПСМА 2-PMPA. Видно, что пептид PSMA/C1-C2 крепится к мембране ПСМА-положительных клеток 22Rv1 (рис. 4), однако при совместной инкубации с 2-PMPA сигнал флуоресценции статистически неотличим от контроля, что говорит о конкурентном связывании PSMA/C1-C2 и 2-PMPA с ПСМА.

Рис. 4. Степень прикрепления PSMA/C1-C2 при наличии и отсутствии специфического ингибитора ПСМА (ОФК – общая флуоресценция клеток; * – отличие от контроля)

Fig. 4. Degree of PSMA/C1-C2 attachment with and without a specific PSMA inhibitor (CTCF – Corrected Total Cell Fluorescence; * – difference from control)

Заключение. Таким образом, структура, созданная на основе токсина U5-scytotoxin-Sth1a с помещенным в положение С1-С2 коротким пептидом, тропным к ПСМА, сохраняет повышенную стабильность без потери способности связываться с целевым рецептором на поверхности клеток и не затрагивает клетки, не экспрессирующие ПСМА.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект № 123020700216 (FEUF-2023-0004)).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Белобородов Е.А., Юрова Е.В., Фомин А.Н., Саенко Ю.В.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Белобородов Е.А.,

Юрова Е.В., Сугак Д.Е.

Статистическая обработка данных: Расторгуева Е.В.

Анализ и интерпретация данных: Белобородов Е.А., Юрова Е.В., Саенко Ю.В.

Написание и редактирование текста: Белобородов Е.А., Юрова Е.В.