Исследование пробиотических свойств бактерий рода Propionibacterium

Пробиотики - полезные для организма микроорганизмы, подавляющие развитие дисбактериоза, в результате чего обладающие профилактическими свойствами к хроническим заболеваниям, связанным с метаболическими нарушениями (ожирение, диабет 2-го типа, атеросклероз и т. п.) [1]. Среди пробиотиков наиболее изученными являются молочнокислые бактерии рода Lactobacillus и Bifidobacterium [2]. Кроме данных представителей в качестве пробиотиков могут использоваться и бактерии рода Propionibacterium [3].

Propionibacterium - это неспорообразующие, анаэробные и толерантные к низким концентрациям кислорода бактерии, которые имеют в своей клеточной стенке много муреина, то есть являющиеся грамположитель-ными. Данные бактерии используют при производстве швейцарских сыров [4], они способны преобразовывать углеводы в уксусную и пропионовую кислоты, метаболизировать витамины, бактериоцины (пропионат, ацетат, диацетил), бифидогенные соединения, вещества, проявляющие иммуномодулирующие, антиканцерогенные свойства [5]. Propioni-bacterium подразделяются на два вида, первый обитает на кожных покровах, второй является «молочным» видом, обитающим в сыром молоке и кисломолочных продуктах [6]. В рамках данной работы интерес представляют «молочные» виды:

• •    Propionibacterium freudenreichii - молочнокислая бактерия, которая используется в качестве закваски для приготовления сыров, является продуцентом короткоцепочных жирных кислот, витаминов В9, В12 и бифидоген-ных соединений (1,4-дигидрокси-2-нафтои-новую кислоту) - соединений, стимулирующих рост бактерий группы Bifidobacterium [7] .

• •    Propionibacterium acidipropionici - молочная бактерия, продуцирующая фермент в-галактозидазу, расщепляющую лактозу, и бактериоцины. В результате чего активно используется в приготовлении функциональных

продуктов питания для населения, имеющего проблемы с непереносимостью лактозы [7], и для профилактики нарушений, вызванных патогенными и/или условно патогенными штаммами (например, Bacteroides fragilis и Clostridium hystoliticum ) [8].

• •    Propionibacterium jensenii - молочная пропионовокислая бактерия, являющаяся продуцентом витамина В12, участвующего в регулировании уровня холестерина, гомоцистеина, триглицеридов [9] и фермента в-галактозидазы [10].

• •    Propionibacterium thoenii - пропионовокислая бактерия «молочного» вида, обладающая способностью к продуцированию фермента в—галактозидазы и бактериоцинов (про-пионицина [10] и тениицина [11]).

Благодаря способности к продуцированию данных биологически активных веществ бактерии рода Propionibacterium актуально использовать как в качестве самостоятельных проботиков, так и в составе поли-компонентных добавок. Сегодня существует большое количество изобретений, в которых используются бактерии рода Propioni-bacterium , однако в рамках пищевой биотехнологии данные бактерии в основном применяются в качестве продуцента белка [12, 13], закваски для изготовления кисломолочных продуктов питания [14–16], композиции, используемой для увеличения срока хранения продукции [17]. В качестве пробиотиков отечественные исследователи в основном используют Propionibacterium freudenreichii [18], Propionibacterium acidipropionici, а также их смесь с другими молочнокислыми бактериями [19, 20]. В зарубежных исследованиях используют Propionibacterium jensenii [21, 22] и Propionibacterium freudenreichii [23], и их смесь с другими штаммами [24]. Недостатками данных изобретений является отсутствие информации о наличии одних из наиболее важных свойств, присущих пробиотикам: антимикробной активности по отношению к патогенным и условно-патогенным штаммам, устойчивости к действию антибиотиков.

Цель данной работы - изучить пробиотические свойства бактерий рода Propioni-bacterium ( P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723), а именно устойчивость штаммов к действию антибиотиков и наличие антимикробной активности.

Объекты и методы исследований

Исследование проводилось на базе Лаборатории биотестирования природных нутрицевтиков ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет». В качестве объектов исследования использовались штаммы пропионовокислых бактерий, полученные из ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» Propionibacterium jensenii В-6085, Propioni-bacterium freudenreichii В-11921; Propionibacterium thoenii В-6082; Propionibacterium acidipropionici В-5723 (табл. 1).

Определение устойчивости к антибиотикам. Антибиотикорезистентность пропионовокислых бактерий определяли дискодиффузионным методом [29], который основан на диффузии антимикробных препаратов из пропитанных бумажных дисков в питательную среду. Для этого суспензию исследуемых штаммов высевали сплошным газоном чашки Петри со средой ГРМ (HiMedia, Индия) и одновременно раскладывали на поверхность агара диски с антибиотиками (HiMedia, Индия). Через 24 ч культивирования в термостате при 28 °С фиксировали результаты эксперимента. Интерпретацию результатов устойчивости пропионовокислых бактерий к антибиотикам осуществляли по диаметру зон подавления роста штаммов: диаметр зоны подавления роста менее 10 мм -устойчивый, 10-15 мм - малая чувствительность; 15-25 - чувствительный, более 25 -высокая чувствительность.

Определение антагонистической активности штаммов пропионовокислых бактерий осуществляли согласно методике, описанной в [30]. Для этого исследуемые штаммы инкубировали в стерильном обезжиренном молоке при температуре 28 °С в течение 76 ч, после центрифугировали полученную суспензию. В дальнейшей работе использовали отфильтрованный через мембранные фильтры (диаметр пор 22 µm) супернатант. Антагонистическую активность определяли в отношении патогенных и условно-патогенных тест-штаммов: Escherichia coli , Salmonella enterica , Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa , Proteus vulgaris . В работе использовали ночную культуру перечисленных штаммов. Плотность суспензии пропионовокислых бактерий определяли при помощи денсиметра DEN-1 (BioSan, Латвия). Антагонистическую активность пропионовокислых бактерий

Таблица 1

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки отдельных штаммов

Наименование штамма Культуральноморфологические признаки Физиолого-биохимические признаки Источник P. jensenii Грамположительные, неспорообразующие, слегка овальные палочки, факультативные анаэробы Каталазоположительные, сбраживают глюкозу, лактозу, трегалозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маннозу, рамнозу, маннитол, инозитол, не разжижают желатин, оптимальная температура 28-30 °C [25-28] P. freudenreichii Грамположительные, неспорообразующие, кокковидной формы, факультативные анаэробы Каталазоположительные, сбраживают лактозу, глюкозу, рибозу, маннозу, мальтозу, галактозу, рамнозу, фруктозу, оптимальная температура 30 °C P. thoenii Грамположительные, неспорообразующие, булавовидные палочки, факультативные анаэробы Каталазоотрицательные, сбраживают мальтозу, рибозу, ксилозу, галактозу, фруктозу, сорбитол, лактозу, трегалозу, сахарозу, оптимальная температура 28-30 °С [25-27] P. acidipropionici Грамположительные, неспорообразующие, слегка овальные палочки, факультативные анаэробы Каталазоотрицательные, сбраживают арабинозу, рибозу, галактозу, фруктозу, инозитол, маннитол, сорбитол, мальтозу, лактозу, оптимальная температура 30 °С определяли диско-диффузионным методом: тест-штамм высевали сплошным газоном на питательную среду; по поверхности засеянной среды раскладывали бумажные диски, пропитанные очищенным супернатантом. Интерпретацию результатов осуществляли по диаметру зон подавления роста тест-штаммов: диаметр зоны подавления роста менее 8 мм -активность отсутствует, 8-13 мм - слабая активность; 13-18 - средняя активность, более 18 - высокая активность.

Для создания пробиотического консорциума важно использовать биосовместимые штаммы, проявляющие устойчивость к антибиотикам и антимикробную активность по отношению к патогенной и условнопатогенной микрофлоре. Для определения биосовместимости исследуемых культур пропионовокислых бактерий использовали капельный метод [31]. Для этого на поверхность агаризованной среды наносили каплю одной суточной культуры, после высыхания наносили каплю второй суточной культуры, и культивировали при температуре 28 °С в течение 24-36 ч. Опыт повторяли со всеми 4-я иссле- дуемыми штаммами. Результаты интерпретировали следующим образом: в случае слияния капель - «+» культуры биосовместимы, в случае перекрытия одного штамма другим - «-» культуры проявляют антагонизм.

Результаты и их обсуждение

В ходе исследовательской работы изучены пробиотические свойства штаммов пропионовокислых бактерий. Результаты определения устойчивости исследуемых штаммов ( Propionibacterium jensenii В-6085, Propionibacterium freudenreichii В-11921; Propionibacterium thoenii В-6082; Propionibacterium acidipropionici В-5723) к действию ряда антибиотиков (ампициллин, бензилпенициллин, карбенициллин, полимиксин, стрептомицин, гентамицин, клотримазол, левомицитин, тетрациклин, неомицин, канамицин) представлены в табл. 2.

Результаты по изучению устойчивости к антибиотикам показали, что большинство исследуемых пропионовокислых бактерий обладают малой чувствительностью (16,7 %) и высокой устойчивостью (35,4 %) к антибиотикам. Лишь 2 культуры показали высокую

Таблица 2

Результаты изучения антибиотикорезистентности штаммов пропионовокислых бактерий

Наименование антибиотика Диаметр зоны подавления роста, мм P. jensenii В-6085 P. freudenreichii В-11921 P. thoenii В-6082 P. acidipropionici В-5723 Ампициллин 7,0 ± 0,1 8,0 ± 0,2 6,0 ± 0,2 9,5 ± 0,3 Бензилпенициллин 20,0 ± 0,8 20,5 ± 0,8 6,0 ± 0,2 22,0 ± 0,9 Карбенициллин 6,0 ± 0,1 6,0 ± 0,2 17,0 ± 0,6 18,0 ± 0,7 Полимиксин 22,0 ± 0,9 26,5 ± 1,1 12,5 ± 0,4 6,0 ± 0,1 Стрептомицин 9,5 ± 0,4 15,0 ± 0,5 22,0 ± 0,9 16,0 ± 0,6 Гентамицин 14,0 ± 0,5 21,0 ± 0,8 9,5 ± 0,2 25,0 ± 1,0 Клотримазол 6,0 ± 0,1 12,0 ± 0,4 21,5 ± 0,8 6,0 ± 0,2 Левомицитин 6,0 ± 0,1 6,0 ± 0,2 23,0 ± 0,9 10,0 ± 0,3 Тетрациклин 25,0 ± 1,0 18,0 ± 0,7 10,0 ± 0,5 27,0 ± 1,1 Неомицин 14,5 ± 0,7 24,0 ± 1,0 14,5 ± 0,5 12,5 ± 0,4 Канамицин 10,0 ± 0,3 13,0 ± 0,4 7,0 ± 0,2 6,0 ± 0,1 чувствительность: P. freudenreichii В-11921 по отношению к полимиксину (26,5 мм), P. acidipropionici В-5723 по отношению тетрациклину (27,0 мм). Таким образом, в основном культуры пропионовокислых бактерий обладают антибиотикорезистентностью.

Антагонистическую способность пропионовокислых культур определяли в отношении тест-культур: Escherichia coli , Salmonella enterica , Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa , Proteus vulgaris . Результаты исследования представлены в табл. 3.

Исходя из результатов исследования антагонистической активности, можно сделать вывод о том, что все исследуемые штаммы обладают ингибирующим действием в отношении патогенных и условно-патогенных штаммов. Высокой активностью обладают 90 % исследуемых пропионовокислых культур. При этом лишь 1 штамм ( P. jensenii В-6085) характеризуется средней активностью в отношении тест-культур.

Для создания пробиотического консорциума на дальнейших этапах работы проанализирована биосовместимость культур пропионовокислых штаммов по отношению друг к другу (табл. 4).

Из табл. 4 следует, что все комбинации исследуемых штаммов являются биосовмес-тимыми, вследствие чего можно рекомендовать к использованию в создании консорциумов пробиотического действия.

Растущий интерес потребителя к укреплению здоровья и профилактике хронических заболеваний стимулирует развитие рынка ФПП, в частности развитие добавок, продуктов с пробиотическими штаммами. Данная работа направлена на изучение полезных свойств «молочных» пропионовокислых бактерий для их дальнейшего применения в качестве пробиотика. Исследование позволило оценить способность бактерий P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723 проявлять антимикробную активность по отношению к ряду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, данное действие обусловлено способностью штаммов к синтезу бактерио-цинов, подавляющих жизнедеятельность гра-мотрицательных бактерий, дрожжей и плесневелых грибов [32]; оценить высокую устойчивость штаммов к действию антибиотиков.

Проведенное исследование подробно рассмотрело возможность использования бактерий P. jensenii В-6085, P. freudenreichii В-11921, P. thoenii В-6082 и P. acidipropionici В-5723 в качестве пробиотиков. В дальнейших исследованиях авторы планируют изучение пробиотических свойств консорциумов, составленных на основании данных о биосовместимости выше представленных штаммов.

Таблица 3

Результаты изучения антагонистической активности штаммов пропионовокислых бактерий

Тест-культура	Диаметр зоны подавления роста, мм
	P. jensenii В-6085	P. freudenreichii В-11921	P. thoenii В-6082	P. acidipropionici В-5723
Escherichia coli	21,5 ± 1,4	21,0 ± 1,1	21,0 ± 1,2	20,0 ± 1,0
Salmonella enterica	18,0 ± 0,9	19,5 ± 1,0	20,5 ± 1,0	18,5 ± 0,9
Staphylococcus aureus	19,0 ± 1,1	22,5 ± 1,4	18,0 ± 1,0	19,5 ± 1,0
Pseudomonas aeruginosa	17,0 ± 0,8	18,5 ± 0,9	18,5 ± 0,9	22,0 ± 1,1
Proteus vulgaris	15,0 ± 0,6	21,0 ± 1,2	18,0 ± 0,8	20,0 ± 1,0

Таблица 4

Результаты изучения биосовместимости пропионовокислых штаммов бактерий

Наименование штамма	Наименование штамма
	В-6085	В-11921	В-6082	В-5723
В-6085		+	+	+
В-11921	+		+	+
В-6082	+	+		+
В-5723	+	+	+

Работа выполнена в рамках гранта Президента РФ при государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-2694.2020.4).