Исследование промежуточных пшенично-пырейных гибридов на устойчивость к листовой ржавчине

Листовая (бурая) ржавчина (возбудитель Puccinia triticina Eriks.) — заболевание пшеницы, причиняющее серьезный ущерб ее посевам, особенно в южных регионах России. При поражении урожай может снижаться более чем на 50 % (1). В настоящее время выявлено свыше 50 генов устойчивости к листовой ржавчине (2), на многие из которых разработаны молекулярные маркеры (3). Источниками таких генов часто служат дикорастущие сородичи пшеницы. В частности, гены Lr24, Lr29 и Lr19 пырея понтийского ( Thinopyrum ponticum , геномная конституция JJJJ^sJ^s, 2 n = 70) и ген Lr38 пырея среднего ( Th. intermedium , геномная конституция JSJ^s, 2 n = 42), перенесенные в пшеницу посредством межродовой гибридизации, обеспечивают ее устойчивость к широкому спектру рас бурой ржавчины (4). Возникновение и распространение новых рас в разных странах приводит к потере устойчивости, обусловленной этими генами (5-7). Поиск новых генов, определяющих как полную, так и частичную устойчивость пшеницы к листовой ржавчине, поможет создать пирамидальную систему устойчивости сортов. Кроме того, введение в коммерческие сорта пшеницы новых генов с помощью отдаленной гибридизации позволит сдержать коэволюцию хозяина и паразита.

Большим потенциалом в качестве источника новых генов устойчивости обладает коллекция пшенично-пырейных гибридов (ППГ), созданных в Отделе отдаленной гибридизации Государственного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН при скрещивании пшеницы (как мягкой, так и твердой) с разными видами пырея (в том числе с пыреем средним и понтийским). Известно, что у этих линий в разной степени проявляется многолетний образ жизни, способность к отрастанию после скашивания, они имеют длинный рыхлый колос, характерный для многолетней пшеницы. Ранее нами было показано, что такие формы — октаплоиды (2 n = 56) (8).

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках выполнения ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлением развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» ГК № 14.518.11.7043.

К важным этапам создания устойчивых форм пшеницы относится их иммунологическая оценка (9). Фитопатологический анализ указанных форм ППГ не проводился, и об их относительной устойчивости известно только из полевых наблюдений, результаты которых сильно подвержены влиянию внешней среды (10).

Целью нашей работы был скрининг коллекции озимых пшеничнопырейных гибридов на наличие пырейного генома и устойчивость к листовой ржавчине.

Методика . Объектом исследования служили образцы озимых ППГ Истра 1, Зернокормовая 169, Останкинская, Отрастающая 38, №№ 12, 33, 77, 90, 116, 186, 548, 1405, 1670, 2087, 4015, 4044, 4082, 5542 (Отдел отдаленной гибридизации Государственного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН), полученные в результате ступенчатых скрещиваний с участием мягкой и твердой (образцы № 33 и № 90) пшеницы Triticum aestivum , пырея среднего и пырея понтийского. При ПЦР-анализе в качестве контроля использовали пырей средний (образец PI 401200, GRIN) и пырей удлиненный (образец PI 547312, GRIN), отрицательным контролем был сорт мягкой пшеницы Chinese Spring.

Для ПЦР-анализа ДНК выделяли CTAB-методом из этиолированных проростков по методу R. Bernatzky и S.D. Tanksley (11). В качестве маркеров на геном пырея использовали RAPD-маркер OPN01 (12), специфичный для S-субгенома, а также SCAR-маркеры F03 (13) и ple2 (14), специфичные для J-субгенома. Условия амплификации приведены в таблице 1. Полученные фрагменты разделяли в 1,5 % агарозном геле при напряженности поля 6 В/см.

1. Использованные прямые (F) и обратные (R) праймеры, условия ПЦР-ам-плификации и ожидаемый размер ампликонов для маркеров, специфичных для субгеномов пырея

Пара праймеров/праймер       |            Режим амплификации

Маркер F 0 3 (ожидаемый размер ампликона — 1270 п.н.) F 5'-TGATCACCTGGTTGATAAGTCA-3'       1 цикл — 94 °C 3 мин; 20 циклов — 94 °C 45 с, 58 °C 30 с,

R 5'-AAAGTATTTATTCACTCAACCGGATCT-3' 72 °C 60 с; 1 цикл — 72 °C 10 мин

Маркер O P N 0 1 (ожидаемый размер ампликона — 817 п.н.) 5'-CTCACGTTGG-3'                          1 цикл — 94 °C 4 мин; 5 циклов — 92 °C 30 с, 35 °C 2 мин,

72 °C 90 с; 35 циклов — 92 °C 5 с, 40 °C 20 с, 92 °C 90 с; 1 цикл — 72 °C 5 мин

Маркер ple2 (ожидаемый размер ампликона — 250 п.н.) F 5'-ACAATCTGAAAATCTGGACA-3'          1 цикл — 94 °C 4 мин; 28 циклов — 94 °C 60 с, 60 °C 60 с,

R 5'-TCATATTGAGACTCCTATAA-3'          72 °C 2 мин; 1 цикл — 72 °C 10 мин.

При изучении устойчивости к листовой ржавчине 5-суточные проростки инокулировали урединиоспорами тест-изолятов, затем на 16-20 ч помещали во влажную камеру, после чего переносили в климатическую камеру PGV-36 («Thermo Fisher Scientific», Австралия) (температура воздуха +20 ° C, относительная влажность воздуха 60-70 %, освещенность 1015 тыс. лк, фотопериод 16 ч) и на 10-е сут учитывали тип реакции у образцов и моногенных линий.

Резуёътаты . Устойчивость к 10 тест-изолятам возбудителя листовой ржавчины Puccinia triticina Eriks. (табл. 2) изучили у 16 образцов ППГ.

2. Характеристика тест-изолятов возбудителя листовой ржавчины Puccinia triticina Eriks., использованных в работе

Тест-изолят	Набор генов вирулентности	Происхождение тест-изолята (год, регион, сорт)
550-4	1, 2à, 2b, 2c, 3a, 3bg, 11, 14a, 17, 18, 20, 21, 25, 30, 32, 33, 39, 40, B	2005, Нижневолжский, Виктория 95 (озимый)
555-6	1, 2à, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3 ka, 10, 14a, 14 b, 17, 18, 23, 25, 26, 27+31, 30, 32, 33, 40, B	2005, Cеверо-Кавказский, Ростовчанка (озимый)

558-3

681-13

687-5

689-5

693-5

698-1

702-5

717-2

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3 ka, 10, 11, 14a, 14b, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 27+31, 30, 32, 33, 39, 40, 44, 46, B

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 14a, 17, 18, 19, 20, 23, 25, 30, 32, 33, 39, 40, B

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 14a, 14b, 17, 18, 20, 23, 25, 26, 30, 32, 33, 39, 40, B

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 14a, 14b, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 27 + 31, 30, 33, 39, 40, B

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 14a, 14b, 15, 16, 17, 18, 20, 23, 25, 26, 30, 32, 33, 39, 40, B

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 14a, 14b, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 25, 26, 30, 32, 33, 39, 44, B

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 14a, 14b, 16, 17, 18, 20, 21, 23, 25, 26, 30, 32, 33, 36, 39, 40, B

• 1,    2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 14a, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 27+31, 30, 32, 33, 39, 40, B

  Продолжение таблицы 2

  2005, Центральный, Обская 14 (яровой)

  2008, Западно-Сибирский, Терция (яровой)

  2008, Северо-Кавказский, Тритикале (озимый)

  2008, Северо-Кавказский, Мичиган Амбер (озимый)

  2008, Северо-Кавказский, Краснодарская 99 (озимый)

  2008, Центрально-Черноземный, Волжская 100 (озимый)

  2008, Центрально-Черноземный, Московская 39 (озимый)

  2008, Средневолжский, Смуглянка (озимый)

  
  

  • 3. Наличие («+») или отсутствие (« - ») реакции на заражение пшенично-пырейных гибридов тест-изолятами возбудителя листовой ржавчины Puc-cinia triticina Eriks., использованных в работе

    Образец, сорт

    Тест-изолят 558-3 | 693-5 | 698-1 | 687-5 | 681-13 | 550-4 | 555-6 | 702-5 | 717-2 | 689-5

    № 12 № 33 № 77 № 90 № 116 № 186 № 548 № 1405 № 1670 № 2087 № 4015 № 4044 № 4082 № 5542 Останкинская Истра 1 Отрастающая 38 Зернокормовая 169 Chinese Spring

    +     +     -     +      +       +      +     +     +     + +     +     +     +      +       +      +      -      +     + -      +      -      -        -        -       -      -      +      + +      -      +      -       -       -      -      +      -      - -     -     +     +       -       -      +     +     -     + -       +       +       -         -          -        -        -        -       - +     +     +     +      +       -      +     +     +     + +      +      +      +        -        -       -       +      -      - -      -      -      +       -       -      -      +      -      - +      +      +      -       +       -      +      +      +      - -      +      -      -       -       +      +      -      -      - +     +     +     +      +      +     +     +     +     +

    По результатам испытания было выделено три группы линий: проявившие иммунитет ко всем тест-изолятам (№№ 77, 90, 548, 1405, 2087, 4015, сорт Истра 1), показавшие восприимчивость к 1-5 тест-изолятам (№№ 116, 186, 1670, 4044, 5542, сорта Останкинская, Зернокормовая 169) и более чем к 5 тест-изолятам (№№ 12, 33, 4082, сорт Отрастающая 38). При этом сорт Chinese Spring, не несущий Lr -генов, обеспечивающих ювенильную устойчивость, был тотально восприимчив ко всем тест-изолятам. Патотипы, выделенные в различных регионах Российской Федерации, значительно различаются по спектру вирулентности (15). Линии из первой и второй групп могут быть рекомендованы как источники для поиска новых генов устойчивости к широкому спектру патотипов, распространенных на территории России, образцы из третьей группы — использоваться в селекции на устойчивость лишь локально в соответствии с принадлежностью тест-изолята, к которому линия проявила устойчивость.

Ранее мы показали, что изучаемые образцы несут в геноме 56 хромосом (16). Согласно проведенным исследованиям с использованием методики геномной гибридизации in situ, кариотип октаплоидных пшенично-пырейных гибридов содержит 42 хромосомы пшеницы и 14 хромосом пырея (16), хотя возможны и отклонения от этих значений (17).

Для установления субгеномного состава изучаемые образцы ППГ были проанализированы с помощью ПЦР-маркеров, специфичных для субгеномов у полиплоидных видов пырея, используемых в селекции (пырей средний — JSJs, пырей понтийский — JJJJsJs). По маркерам F03 и ple2, специфичным для J-генома, получили продукт амплификации на всех линиях, по OPN01, специфичному для субгенома S, — продукт амплификации на всех линиях, кроме линии № 116 (рис.).

Mill 1  2  2  2  2  3  3

Пример отсутствия (1 — пшенично-пырейный гибрид ППГ № 5787) и наличия (2 — ППГ № 1754, 3 — ППГ № 1867) амплификации целевого бэнда (817 п.н.) при использовании маркера OPN01 на S-геном пырея. М — маркер молекулярных масс Gene Ruler 100 bp («Fermentas», Литва).

Таким образом, все образцы (за исключением № 116) содержат в геноме комбинацию хромосом пырея, относящихся к различным субгеномам (S, J или Js), а образец № 116 не несет хромосом субгенома S.

Ранее с использованием метода GISH мы обнаружили неодинаковый состав хромосом пырея у сортов Истра 1, Зернокормовая 169, Останкинская и Отрастающая 38 (16). В настоящем исследовании показаны различия между этими четырьмя образцами по спектру устойчивости к листовой ржавчине. Следовательно, имеются основания предположить, что полиморфизм ППГ по устойчивости обусловлен неодинаковыми наборами хромосом пырея. У остальных образцов ППГ выявлено несходство по спектру устойчивости, а также полиморфизм по геномному составу (на основании амплификации ПЦР-маркеров). Исходя из полученных данных можно заключить, что и у этих образцов степень устойчивости к листовой ржавчине зависит от комбинации хромосом пырея, представляющих разные субгеномы.

В экспериментах других авторов из перечисленных выше образцов устойчивость к листовой ржавчине изучили только у сорта Отрастающая 38, получившего оценку 2 - по 4-балльной шкале (0 — иммунитет) (18). В проведенном нами тесте растения сорта Отрастающая 38 также проявили частичную устойчивость (только к трем тест-изолятам). У сортов Останкинская, Истра 1 и Зернокормовая 169 в результате длительных полевых наблюдений была установлена комплексная устойчивость к ряду заболеваний, в том числе к бурой ржавчине (10). По результатам проведенного нами испытания сорт Истра 1 обладал иммунитетом ко всем тест-изолятам, сорта Зернокормовая 169 и Останкинская показали восприимчивость соответственно к трем и двум тест-изолятам. Сорта Истра 1, Останкинская и Зернокормовая 169 получены позже сорта Отрастающая 38 и демонстрируют более высокие показатели по укосу зеленой массы и урожайности зерна (10). Перечисленные признаки могли быть улучшены в том числе за счет повышения устойчивости к листовой ржавчине.

Итак, полученные нами ранее молекулярно-цитогенетические мар- керы пырейных хромосом для указанных выше четырех сортов, а также дальнейшие молекулярно-цитогенетические и молекулярные исследования, выполненные на остальных линиях пшенично-пырейных гибридов (ППГ), в совокупности с результатами фитопатологической оценки могут быть использованы при картировании генов устойчивости к листовой ржавчине и разработке их молекулярных маркеров. В перспективе применение таких маркеров позволит направленно интрогрессировать новые Lr-гены пырея из ППГ в мягкую пшеницу и подобным образом создавать устойчивые линии и сорта.