Исследование противоопухолевых и антиметастатических свойств растительных средств из аконита байкальского

НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН, Иркутский институт химии СО РАН, Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Алкалоидоносные растения считаются одними из перспективных для использования в медицинской практике. Многие алкалоиды высоко специфичны и имеют сложное строение молекул, что затрудняет их синтез. Представители рода Aconitum семейства Ranunculaceae широко известны как продуценты дитерпеновых алкалоидов. Представитель этого рода аконит байкальский (Асоnitum baicalense Тurcz. ex Rapaics (A. Czekanovskyi Steinb.) эндемичен для Восточной Сибири. Изучение химического состава этого вида показало наличие дитерпеновых алкалоидов. В составе растений обнаружен новый алкалоид N-окись 12-эпинапеллин, идентифицированы известные третичные основания гипаконитин, мезаконитин, зонгорин, напеллин [5, 6, 7]. Установлено, что растение синтезирует комплекс флавоноидных гликозидов и других полифеноль-ных соединений, структуру которых установили как 7-а-Х рамнопиранозиды кемпферола и кверцетина, ацилглюкозид п-кумаровой кислоты, 2а-(3-метокси-4-гидроксифенил)-3Р-гидроксиметил-7-метокси-5-(3-гидроксипропил) бензо[b]фуран и 2-(3-метокси-4-гидроксифенил)-этанол. Установ- лена химическая структура нового ацилированного олигозида кверцетина, названного чеканозидом А [8]. Ранее нами было показано, что препараты из аконита байкальского обладают адаптогенными свойствами, повышают устойчивость организма к различным повреждающим факторам [10].

Целью данного исследования явилось экспериментальное изучение противоопухолевых и ан-тиметастатических свойств растительных средств, полученных на основе аконита байкальского.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили водно-этанольные вытяжки из надземной части аконита байкальского, которые представляют комплекс действующих и сопутствующих веществ, извлекаемых из измельченной травы 25-40% раствором этилового спирта при соотношении сырья и экстрагента 1:50 (2% – настойка 2 ), 1:20 (10% – на-стойка 10 ), 1:1 (экстракты жидкий и сухой), а также вытяжка суммы алкалоидов и суммы фенольных соединений — бутанольная фракция. Сырье было собрано в окрестностях г. Иркутска. В качестве препаратов сравнения использовали синтетический антиметаболит — 5-фторурацил и растительный препарат из чаги — бефунгин.

Эксперименты проведены на мышах линий C57BL/6, FL(C57BL/6xCBA) и рандомбредных мышах разводки питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. В качестве моделей опухолевого роста использованы саркома Крокера, асцитная карцинома Эрлиха, меланома В-16, карцинома легких Льюис. Перевивку опухолей проводили стандартными методами. Об эффективности ле- чения судили по темпу роста опухоли и продол жительности жизни животных. Процент тормо жения роста опухоли (по массе и объему опухо левого узла или объему опухолевых клеток в ас цитном варианте) вычисляли по формуле:

Средний показатель роста опухоли в контроле – средний показатель роста опухоли в опытной группе

ТРО% = --------------------------------------------- х 100.

Средний показатель роста опухоли в контроле

Увеличение продолжительности жизни животных (%) рассчитывали по формуле:

Средняя продолжительность жизни в опытной группе – средняя продолжительность жизни в контроле

—

Средняя продолжительность жизни в контроле

Об интенсивности развития метастатического процесса судили по среднему количеству гематогенных субплевральных метастазов на одно животное в группе, частоте метастазирования опухолей (процент животных с метастазами), средней массе лимфогенных метастазов. Индекс ингибиции метастазирования (ИИМ) рассчитывали по формуле:

(Ак х Вк) - (А х В)

ИИМ = ------------------ х 100%,

(Ак х Вк)

где А к , А - частота метастазирования в контрольной и опытной группах; В к , В – среднее число метастазов у животных контрольной и опытной групп соответственно [ 1 ] .

Статистическую обработку полученных результатов проводили путем расчета средней (χ) и среднеквадратичной ошибки (m) . О достоверности различий судили, используя параметрический критерий (Стьюдента) в случае распределения близкого к нормальному либо непараметрический критерий Вилкоксона - Манна-Уитни для выборок, распределение которых отличалось от нормального. Для сравнения результатов экспе- риментов, где показатели выражались в долях, достоверность различий оценивали по критерию углового преобразования Фишера [4]. Различия считали достоверными при Pt, Pu<0,05. Часть результатов обработана на компьютере х 100. с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 5,0 FOR WINDOWS.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мы показали, что настойка 2 аконита в дозе 10,0 мл/кг на 50 % тормозила рост саркомы Крокера, а в дозе 2,5 мл/кг на 56,7 % снижала темп роста асцитной карциномы Эрлиха, устраняя при этом лейкоцитоз и увеличивая содержание гемоглобина в крови животных. Другие растительные средства из аконита также вызывали умеренное торможение опухолевого процесса. Так, бутанольная фракция (1,1 мг/кг) и сумма алкалоидов (0,05 мг/кг) увеличивали продолжительность жизни мышей с карциномой легких Льюис на 66,5 и 65,4 %. Настойка 10 и сухой экстракт (16,2 мг/кг) на 43 и 39 % увеличивали продолжительность жизни животных с этой опухолью. Жидкий экстракт (0,2 мл/кг) достоверного действия не оказывал (табл. 1).

Для сравнительного исследования противо-метастатической активности были использованы следующие лекарственные формы аконита байкальского: настойка 2 , настойка 10 , экстракты жидкий и сухой, сумма алкалоидов. Назначали также 5-фторурацил (15,0 мг/кг) – антиметаболит из группы фторпиримидинов, обладающий широким спектром противоопухолевой активности и

Таблица 1

Влияние препаратов аконита (Асonitum baiсalense) на продолжи т ельность жизни мышей линии C57BL/6 c карциномой легких Льюис ( X ± m)

Препарат	Число животных	Средняя продолжительность жизни, дни	УПЖ , %	Количество выживших животных, %
Контроль (спирт)	9	48,8 ± 6,1	-	10,0
Настойка 10	8	70,0 ± 6,7*	43,3	37,5
Контроль (вода)	10	48,9 ± 5,5	-	11,1
Жидкий экстракт	8	65,0 ± 7,0	32,9	37,5
Сухой экстракт	8	67,9 ± 6,7*	38,9	50,0
Бутанольная фракция	8	81,4 ± 3,6*	66,5	62,5*
Алкалоидная фракция	8	80,9 ± 5,7*	65,4	75,0*

Примечание. * - различия статистически достоверны в сравнении с контролем (р< 0,05); УПЖ - увеличение продолжительности жизни.

Т.Н. ПОВЕТЬЕВА, В.Г. ПАШИНСКИЙ, А.А. СЕМЕНОВ и др.

Таблица 2

Влияние растительных средств из Аconitum baiсalense и препаратов н а рост и метастазирование меланомы В-16 у мышей линии F1 (CBA x C57BL/6) ( X ± m)

Препарат	Число животных	Среднее число метастазов	Торможение роста метастазов, %	Частота метастазирования, %	ИИМ
Контроль	15	18,2 ± 2,2	0	100	-
5-фторурацил	10	15,8 ± 2,6	13	100	13
Контроль	11	16,3 ± 2,7	0	100	-
Бефунгин	8	14,2 ± 3,8	12,9	50*	56
Контроль	9	6,6 ± 3,4	0	78	-
Настойка 2	5	0,2 ± 0,1*	97*	20*	99
Контроль	10	1,8 ± 0,8	0	80	-
Экстракт жидкий	6	1,7 ± 0,8	5,6	50*	41
Экстракт сухой	8	1,6 ± 1,5	11,1	25*	72
Алкалоиды	7	0*	100*	0*	100

Примечание. * - различия статистически достоверны в сравнении с контролем (p<0,05).

наиболее широко использующийся в онкологической практике [9], и бефунгин (1,0 мл/кг) – по-лугустой экстракт из чаги (березовый гриб). В экспериментальной медицине применение препаратов чаги приводит к задержке развития перевиваемых опухолей, а зачастую и к торможению роста метастазов [ 2, 3 ] .

Результаты исследования с использованием меланомы В-16 приведены в табл. 2. Мышей линии F1 (CBA x C57BL/6) с меланомой В-16 начинали лечить на 11-е сут. 5-фторурацил на этой модели не проявил существенной противомета-статической активности, отмечена лишь тенденция к снижению среднего числа метастазов, индекс ингибирования метастазирования составил 13%. Под действием бефунгина лишь у 50 % мышей были зафиксированы метастазы в легких (в контроле – у 100 %). Процент торможения роста метастазов (по их количеству) в группе, получавшей бефунгин, равен 12,9 (различие с контролем статистически недостоверно), а в группе, получавшей настойку аконита, – 97 (р<0,01). Под влиянием настойки2 аконита только у 20 % животных зафиксированы метастазы (в контроле – у 78 %), среднее число метастазов составило 0,2±0,2 (в контроле - 6,6±3,4), индекс ингибирования метастазирования был в 1,8 раза больше, чем в группе мышей, получавших бефунгин (99 против 56% соответственно). Жидкий и сухой экстракты аконита достоверно снижали частоту метастазирования меланомы В-16. Под действием алкалоидной вытяжки было получено 100 % ингибирование метастазирования, что существенно превосходило по эффективности препарат-прототип бефунгин и препарат сравнения 5-фторурацил.

На следующем этапе мы провели исследование антиметастатической активности на другой модели экспериментальной опухоли - карциноме легких Льюис. Штамм этой опухоли известен высокой степенью поражения легких метастазами. В первой серии экспериментов мышей с перевитыми опухолями оставляли на выживаемость. 5-фторурацил не оказывал достоверного влияния на продолжительность жизни мышей с этой метастазирующей опухолью. Настойка 2 аконита, напротив, в 1,4 раза увеличивала этот показатель, практически так же, как и настойка 10 и сухой экстракт. При назначении жидкого экстракта отмечена явная тенденция к увеличению этого параметра. Растительное средство, содержащее сумму алкалоидов, в 1,7 раза увеличивало продолжительность жизни мышей с опухолью (данные не представлены).

Во второй серии экспериментов изучали влияние растительных средств на рост и диссе-минацию метастазов, в связи с чем животные забивались на 27-е сут после инокуляции опухоле- вых клеток. Результаты опытов показали, что 5-     ки10, настойки2 аконита байкальского и раститель- фторурацил оказал существенное влияние на     ного средства, содержащего сумму алкалоидов.

Таблица 3

Влияние препаратов Aconitum baiсalense на метастазированиекарциномы легкого Льюис у мышей-самцов линии С57В1/6 ( Χ±m)

Препарат	Число животных	Среднее число метастазов	Торможение роста метастазов, %	Частота метастазирования, %	ИИМ
Контроль	10	24,0 ± 5,5	-	100
5-фторурацил	10	14,9 ± 1,9*	38	100	38
Контроль	6	14,0 ± 2,1	-	100	-
Бефунгин	5	6,0 ± 1,5*	57	40	83
Контроль	10	28,2 ± 5,2	-	100	-
Настойка 2	8	14,6 ± 5,8*	48	100	48
Настойка 10	11	10,1 ± 2,9*	64	45,5	84
Жидкий экстракт	11	17,1 ± 5,1	39	72,7	56
Сухой экстракт	10	16,2 ± 4,6	43	80,0	54
Контроль	9	24,4 ± 5,5	-	100	-
Алкалоиды	6	4,5 ± 2,3*	82	82	85

Примечание. * - различия статистически достоверны в сравнении с контролем (р<0,05); ИИМ – индекс ингибирования метастазирования.

среднее количество метастазов (в 1,6 раза снижал этот показатель по сравнению с контролем), но не влиял на частоту метастазирования (табл. 3).

Бефунгин в 2,3 раза уменьшал среднее число метастазов и в 2,5 раза – частоту метастазирования, что сказалось на высоком индексе ингибирования метастазирования – 83 %. Несколько ниже был этот показатель под действием настойки 2 аконита, но среднее число метастазов было в 1,9 раза меньше контрольного. Настойка 10 проявила еще более существенный противометастатический эффект, так как в 2,5 раза снижала среднее число метастатических колоний в легких и в 2,2 раза – частоту метастазирования. При введении жидкого и сухого экстрактов выявлена явная тенденция к уменьшению как среднего числа метастазов, так и числа животных с метастазами, при высоком индексе ингибирования метастазирования. Алкалоидная вытяжка в 5,4 раза снижала среднее количество метастазов, у 82 % животных зафиксирована диссеминация опухолевого процесса, индекс ингибиции метастазирования составил 85 %.

Таким образом, как видно из представленных данных, все средства, содержащие вытяжки из высушенной и измельченной надземной части аконита байкальского, оказывают умеренное противоопухолевое действие. Достаточно высокий про-тивометастатический эффект выявлен у настой-