Исследование противовирусного действия капель Плетнева №30 (селефоклитен) на вирус иммунодефицита человека

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относится к семейству ретровирусов и вызывает заболевание ВИЧ-инфекцию, в терминальной стадии переходящую в синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Вирус иммунодефицита человека является РНК-содержащим вирусом размером 100-200 нм. Вирион содержит суперкапсидную липопротеидную оболочку. Выделение вируса из крови, спермы, мочи, слюны, грудного молока, спинно-мозговой жидкости указывает на риск контакта с любым из этих биологических компонентов.

Возбудитель ВИЧ-инфекции размножается за счет поражения клеток иммунной системы, что представляет опасность для организма. Поэтому стоит отметить актуальность ВИЧ-профилактики и потребность в разработке новых эф-

• ^a E-mail: pletnevtreatment@mail.ru

фективных и безопасных лекарственных средств, которые все же смогут полностью подавить активность вируса.

Исходя из вышесказанного, задачей настоящего исследования явилось изучение противовирусного действия капель Плетнева №30 в отношении вируса иммунодефицита человека.

Для проведения исследований использовали комплексный растительный препарат «Капли Плетнева №30», запатентованный в России. Для получения капель Плетнева №30 используются побеги черники обыкновенной. Препарат представляет собой прозрачную жидкость зеленого цвета и имеет в своем составе β-каротин, витамины С, Р, РР и хлорофилл [2].

Цель исследования

Экспериментальное изучение противовирусного действия капель Плетнева №30 на вирус иммунодефицита человека.

Материалы и методы исследования

Исследование противовирусного действия капель Плетнева №30 (КП №30) в отношении вируса иммунодефицита человека проходило в лаборатории вирусов иммунодефицита (руководитель лаборатории д.м.н., проф. Д.Н. Носик) Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИ-ЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России в соответствии с требованиями Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств от 2012 года [1].

Исследования проведены на перевиваемых лимфобластных клетках человека МТ-4. Клетки культивировали в концентрации 3,0-5,0 х 105 клеток в 1 мл среды RPMI 1640 с 10 % сыворотки эмбрионов коров (производство ФГБНУ ФНЦИ-РИП им. М.П. Чумакова РАН), 100 мкг/мл гентамицина (Фар-махим, Болгария). Жизнеспособность клеток определяли окраской 0,4 % раствора трипанового синего (Sigma, США).

В исследовании использован штамм вируса ВИЧ-1BRU из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

При изучении противовирусного действия КП №30 на ВИЧ степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками «+» или «-» соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю:

«++++» – 100 % гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение; «+++» – 75 % гибель клеток в каждой из четырех лунок; «++» – 50 % гибель клеток в каждой из четырех лунок; «+» – 25 % гибель клеток в каждой из четырех лунок; «+» – начало дегенерации; «-» – отсутствие цитодеструкции.

Методом ИФА с использованием коммерческого иммуно-ферментного набора фирмы Биорад проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости. При исследовании вирулицидного действия КП №30 на ВИЧ в культуре клеток определяли степень ингибирования инфекции.

Результаты и их обсуждение

Изучение цитотоксического действия препарата №30 проведено на лимфобластоидных клетках человека, зараженных ВИЧ.

В работе использованы перевиваемые лимфобластные клетки человека МТ-4 и штамм вируса ВИЧ-1BRU.

Исследование проведено с соблюдением техники безопасности, производственной санитарии и личной гигиены при работе с вирусами в лаборатории.

К клеткам добавляли КП №30 в разведениях 1:10-1:3200. Инкубировали клетки при 37° С в течение 3-6 дней. Жизнеспособность и количество клеток определяли окраской 0,4 % раствора трипанового синего (Sigma, США).

Результаты исследования цитотоксического действия КП №30 при изучении его активности в отношении вируса иммунодефицита человека представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты исследования цитотоксического действия КП №30 на модели лимфобластоидных клеток человека (6-е сутки)

Разведения КП №30	Жизнеспособность, %	Количество клеток в 1 мл х 1000
Контроль клеток	97	1700
1:10	0	0
1:20	0	0
1:50	0	0
1:100	0	0
1:200	40	333
1:400	81	1000
1:800	89	1000
1:1600	95	1333
1:3200	95	1399

Таким образом, КП №30 в разведениях 1:10-1:100 оказывают выраженное цитотоксическое действие на лимфобластные Т-клетки в культуре, вызывая их гибель. Этот эффект заметно снижается начиная с применения КП №30 в разведении 1:200. 50%-ингибирующая концентрация (ИК50) капель Плетнева №30 составляет 1:250.

При изучении противовирусного действия КП №30 на ВИЧ к лимфобластным клеткам человека МТ-4 добавляли КП №30 за 24 ч до инфицирования, одновременно с вирусом и через 24 ч после инфицирования. Инкубировали инфицированные клетки при 37° С в течение 5-7 дней. Результаты учитывали при помощи световой микроскопии – исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуци-рованного синцитийобразования. Методом ИФА проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости. КП №30 во всех вариантах оставались в культуре клеток до момента учета результатов.

На фоне цитотоксического эффекта КП №30 в разведении 1:200 (снижение жизнеспособности клеток в среднем на 40-50 %) отмечено увеличение количества живых клеток по сравнению с контролем вируса (клеток зараженных вирусом, но без препарата), а также подавление цитопатического действия вируса и отсутствие вирусиндуцированных синци-тиев (таблица 2).

Исследование КП №30 в субтоксической 1:400 и в его меньших концентрациях показало наличие дозовой зависимости противовирусного эффекта: с увеличением разведения КП №30 их активность снижалась. 95%-эффективная концентрация (ЭК95) соответствовала разведению КП №30 1:400 при его внесении за 24 ч до инфицирования клеток вирусом (таблица 3). Результаты исследования противовирусного действия КП №30 в отношении вируса иммунодефицита человека представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Результаты исследования противовирусной активности КП №30 на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1

Условия опыта	Жизнеспособность клеток, %	Количество клеток х 103/мл	ЦПЭ/син-цитии, (+)
Внесение КП №30 за 24 ч до инфицирования клеток
Контроль клеток	95	1500	0
Контроль вируса	28	<300	4,0
КП №30 1:200	38	566	0
Внесение КП №30 одновременно с инфицированием клеток
Контроль клеток	95	1500	0
Контроль вируса	33	<300	4,0
КП №30 1:200	35	533	0
Внесение КП №30 через 24 ч после инфицирования клеток
Контроль клеток	95	1500	0
Контроль вируса	21	<300	4,0
КП №30 1:200	19	<300	0

Таблица 3

Результаты исследования противовирусной активности КП №30 на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1

Условия опыта	Жизне-способность клеток, %	Количество клеток х 103/мл	ЦПЭ/син-цитии, (+)	ИФА, (снижение уровня антигена), %
Внесение КП №30 за 24 ч до инфицирования клеток
Контроль клеток	91	2600	0	-
Контроль вируса	39	833	4,0	-
КП №30 1:400	80	2333	0	96,6
КП №30 1:800	76	2000	3,0	62,0
КП №30 1:1600	68	1399	3,5	9,8
Внесение КП №30 одновременно с инфицированием клеток
Контроль клеток	91	2600	0	-
Контроль вируса	35	533	4,0	-
КП №30 1:400	79	2400	0,25	39,7
КП №30 1:800	76	2000	0,75	16,5
КП №30 1:1600	71	2133	1,25	17,1
Внесение КП №30 через 24 ч после инфицирования клеток
Контроль клеток	91	2600	0	-
Контроль вируса	31	<300	4,0	-
КП №30 1:400	63	1833	1,0	70,3
КП №30 1:800	57	1699	2,5	13,3
КП №30 1:1600	45	733	3,0	13,3

Таким образом, КП №30 в разведениях 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600 обладают противовирусным действием при всех схемах его введения: профилактической – за 24 ч до инфицирования, при одновременном введении КП №30 и вируса, а также при внесении КП №30 в культуру клеток через 24 ч после их заражения. Однако, при профилактическом введении КП №30 снижение уровня антигена вируса в культуральной жидкости более выражено и 96,6 %-эффективная концентрация соответствует разведению препарата 1:400 при его внесении за 24 часа до инфицирования клеток вируса иммунодефицита человека. При внесении препарата после инфицирования клеток 70,3 %-ингибирующая концентрация капель Плетнева №30 соответствует его разведению 1:400.

При изучении вирулицидного действия КП №30 на ВИЧ образец вируса обрабатывали КП №30 при 25°С. Лимфобластные клетки человека МТ-4 инфицировали образцами вируса, прошедшего обработку, и контрольными образцами. Инкубировали при 37° С в течение 5-7 дней. Затем учитывали результаты при помощи световой микроскопии – исследование ЦПД.

15-минутный контакт КП №30 в разведениях 1:200-1:3200 с ВИЧ недостаточен для его инактивации. Результаты исследований вирулицидной активности КП №30 представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты исследования вирулицидной активности КП №30 (контакт препарата с внеклеточным, а затем инфицирование клеток)

Препарат	Разведение	Степень ингибирования, log10 ТЦД50
15-минутный контакт
КП №30	1:200	0
	1:400	0
	1:800	0
	1:1600	0
	1:3200	0
60-минутный контакт
КП №30	1:1	5,0
	1:200	1,0
	1:400	0
24-часовой контакт
КП №30	1:200	7,0
	1:400	5,0
	1:800	4,0

Таким образом, при 60-минутной экспозиции КП №30 в разведении 1:1 с вирусом снижается инфекционный титр вируса на 5,0 lg ТЦД50, что соответствует инактивации вируса на 99,999 %. При 24-часовой экспозиции КП №30 в разведениях 1:200, 1:400 и 1:800 с вирусом снижается инфекционный титр вируса на 7,0 lg, 5,0 lg и 4,0 lg ТЦД50 соответственно.

Заключение

Большой практический интерес представляло изучение противовирусного действия капель Плетнева №30 в отношении вируса иммунодефицита человека. В результате проведенных исследований установлено, что в диапазоне испытанных разведений 1:10-1:100 капли Плетнева №30 оказывают выраженное цитотоксическое действие на лимфобластные Т-клетки в культуре, вызывая их гибель. Эффект заметно снижается начиная с разведений 1:200. 50 %-ингибирующая концентрация препарата составляет 1:250.

Капли Плетнева №30 в разведениях 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600 обладают противовирусным действием при всех схемах его введения: профилактической – за 24 ч до инфицирования, при одновременном введении препарата №30 и вируса, а также при внесении капель Плетнева №30 в культуру клеток через 24 ч после их заражения.

При профилактическом введении капель Плетнева №30 снижение уровня антигена вируса в культуральной жидкости более выражено и 96,6 %-эффективная концентрация соответствует разведению препарата 1:400 при его внесении за 24 часа до инфицирования клеток вируса иммунодефицита человека. При внесении препарата после инфицирования клеток 70,3 %-ингибирующая концентрация капель Плетнева №30 соответствует его разведению 1:400.

Экспозиция исходного раствора капель Плетнева №30 в разведении 1:1 с ВИЧ в течение 60 минут приводит к снижению инфекционного титра вируса на 5,0 lg ТЦД50, что соответствует инактивации вируса на 99,999 %. При 24-часовой экспозиции капель Плетнева №30 в разведениях 1:200, 1:400 и 1:800 с вирусом снижается инфекционный титр вируса на 7,0 lg, 5,0 lg и 4,0 lg ТЦД50 соответственно.

В результате проведенных исследований установлено, что капли Плетнева №30 проявляют противовирусную активность в экспериментах in vitro в отношении вируса иммунодефицита человека. Эффективность противовирусного действия капель Плетнева №30 зависит от способа его применения (профилактически до заражения, с лечебной целью), концентрации и длительности экспозиции.