Исследование противовирусного действия капель Плетнева №30 (селефоклитен) на вирус иммунодефицита человека
Автор: Плетнев В.В., Носик Д.Н.
Журнал: Хирургическая практика @spractice
Статья в выпуске: 4, 2018 года.
Бесплатный доступ
При изучении противовирусного действия капель Плетнева №30 на вирус иммунодефицита человека установлено, что препарат при различных схемах введения проявляет выраженную противовирусную активность в отношении вируса иммунодефицита человека в опытах in vitro. Капли Плетнева №30 обладают выраженными вирулицидными свойствами.Капли Плетнева №30 в разведениях 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600 обладают противовирусным действием при всех схемах его введения: профилактической за 24 ч до инфицирования, при одновременном введении капель Плетнева №30 и вируса, а также при внесении капель Плетнева №30 в культуру клеток через 24 ч после их заражения.
Вирус иммунодефицита человека, капли плетнева №30, селефоклитен
Короткий адрес: https://sciup.org/142221861
IDR: 142221861 | DOI: 10.17238/issn2223-2427.2018.4.38-41
Текст научной статьи Исследование противовирусного действия капель Плетнева №30 (селефоклитен) на вирус иммунодефицита человека
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относится к семейству ретровирусов и вызывает заболевание ВИЧ-инфекцию, в терминальной стадии переходящую в синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Вирус иммунодефицита человека является РНК-содержащим вирусом размером 100-200 нм. Вирион содержит суперкапсидную липопротеидную оболочку. Выделение вируса из крови, спермы, мочи, слюны, грудного молока, спинно-мозговой жидкости указывает на риск контакта с любым из этих биологических компонентов.
Возбудитель ВИЧ-инфекции размножается за счет поражения клеток иммунной системы, что представляет опасность для организма. Поэтому стоит отметить актуальность ВИЧ-профилактики и потребность в разработке новых эф-
-
a E-mail: pletnevtreatment@mail.ru
фективных и безопасных лекарственных средств, которые все же смогут полностью подавить активность вируса.
Исходя из вышесказанного, задачей настоящего исследования явилось изучение противовирусного действия капель Плетнева №30 в отношении вируса иммунодефицита человека.
Для проведения исследований использовали комплексный растительный препарат «Капли Плетнева №30», запатентованный в России. Для получения капель Плетнева №30 используются побеги черники обыкновенной. Препарат представляет собой прозрачную жидкость зеленого цвета и имеет в своем составе β-каротин, витамины С, Р, РР и хлорофилл [2].
Цель исследования
Экспериментальное изучение противовирусного действия капель Плетнева №30 на вирус иммунодефицита человека.
Материалы и методы исследования
Исследование противовирусного действия капель Плетнева №30 (КП №30) в отношении вируса иммунодефицита человека проходило в лаборатории вирусов иммунодефицита (руководитель лаборатории д.м.н., проф. Д.Н. Носик) Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИ-ЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России в соответствии с требованиями Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств от 2012 года [1].
Исследования проведены на перевиваемых лимфобластных клетках человека МТ-4. Клетки культивировали в концентрации 3,0-5,0 х 105 клеток в 1 мл среды RPMI 1640 с 10 % сыворотки эмбрионов коров (производство ФГБНУ ФНЦИ-РИП им. М.П. Чумакова РАН), 100 мкг/мл гентамицина (Фар-махим, Болгария). Жизнеспособность клеток определяли окраской 0,4 % раствора трипанового синего (Sigma, США).
В исследовании использован штамм вируса ВИЧ-1BRU из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
При изучении противовирусного действия КП №30 на ВИЧ степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками «+» или «-» соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю:
«++++» – 100 % гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение; «+++» – 75 % гибель клеток в каждой из четырех лунок; «++» – 50 % гибель клеток в каждой из четырех лунок; «+» – 25 % гибель клеток в каждой из четырех лунок; «+» – начало дегенерации; «-» – отсутствие цитодеструкции.
Методом ИФА с использованием коммерческого иммуно-ферментного набора фирмы Биорад проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости. При исследовании вирулицидного действия КП №30 на ВИЧ в культуре клеток определяли степень ингибирования инфекции.
Результаты и их обсуждение
Изучение цитотоксического действия препарата №30 проведено на лимфобластоидных клетках человека, зараженных ВИЧ.
В работе использованы перевиваемые лимфобластные клетки человека МТ-4 и штамм вируса ВИЧ-1BRU.
Исследование проведено с соблюдением техники безопасности, производственной санитарии и личной гигиены при работе с вирусами в лаборатории.
К клеткам добавляли КП №30 в разведениях 1:10-1:3200. Инкубировали клетки при 37° С в течение 3-6 дней. Жизнеспособность и количество клеток определяли окраской 0,4 % раствора трипанового синего (Sigma, США).
Результаты исследования цитотоксического действия КП №30 при изучении его активности в отношении вируса иммунодефицита человека представлены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты исследования цитотоксического действия КП №30 на модели лимфобластоидных клеток человека (6-е сутки)
Разведения КП №30 |
Жизнеспособность, % |
Количество клеток в 1 мл х 1000 |
Контроль клеток |
97 |
1700 |
1:10 |
0 |
0 |
1:20 |
0 |
0 |
1:50 |
0 |
0 |
1:100 |
0 |
0 |
1:200 |
40 |
333 |
1:400 |
81 |
1000 |
1:800 |
89 |
1000 |
1:1600 |
95 |
1333 |
1:3200 |
95 |
1399 |
Таким образом, КП №30 в разведениях 1:10-1:100 оказывают выраженное цитотоксическое действие на лимфобластные Т-клетки в культуре, вызывая их гибель. Этот эффект заметно снижается начиная с применения КП №30 в разведении 1:200. 50%-ингибирующая концентрация (ИК50) капель Плетнева №30 составляет 1:250.
При изучении противовирусного действия КП №30 на ВИЧ к лимфобластным клеткам человека МТ-4 добавляли КП №30 за 24 ч до инфицирования, одновременно с вирусом и через 24 ч после инфицирования. Инкубировали инфицированные клетки при 37° С в течение 5-7 дней. Результаты учитывали при помощи световой микроскопии – исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуци-рованного синцитийобразования. Методом ИФА проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости. КП №30 во всех вариантах оставались в культуре клеток до момента учета результатов.
На фоне цитотоксического эффекта КП №30 в разведении 1:200 (снижение жизнеспособности клеток в среднем на 40-50 %) отмечено увеличение количества живых клеток по сравнению с контролем вируса (клеток зараженных вирусом, но без препарата), а также подавление цитопатического действия вируса и отсутствие вирусиндуцированных синци-тиев (таблица 2).
Исследование КП №30 в субтоксической 1:400 и в его меньших концентрациях показало наличие дозовой зависимости противовирусного эффекта: с увеличением разведения КП №30 их активность снижалась. 95%-эффективная концентрация (ЭК95) соответствовала разведению КП №30 1:400 при его внесении за 24 ч до инфицирования клеток вирусом (таблица 3). Результаты исследования противовирусного действия КП №30 в отношении вируса иммунодефицита человека представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Результаты исследования противовирусной активности КП №30 на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1
Условия опыта |
Жизнеспособность клеток, % |
Количество клеток х 103/мл |
ЦПЭ/син-цитии, (+) |
Внесение КП №30 за 24 ч до инфицирования клеток |
|||
Контроль клеток |
95 |
1500 |
0 |
Контроль вируса |
28 |
<300 |
4,0 |
КП №30 1:200 |
38 |
566 |
0 |
Внесение КП №30 одновременно с инфицированием клеток |
|||
Контроль клеток |
95 |
1500 |
0 |
Контроль вируса |
33 |
<300 |
4,0 |
КП №30 1:200 |
35 |
533 |
0 |
Внесение КП №30 через 24 ч после инфицирования клеток |
|||
Контроль клеток |
95 |
1500 |
0 |
Контроль вируса |
21 |
<300 |
4,0 |
КП №30 1:200 |
19 |
<300 |
0 |
Таблица 3
Результаты исследования противовирусной активности КП №30 на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1
Условия опыта |
Жизне-способность клеток, % |
Количество клеток х 103/мл |
ЦПЭ/син-цитии, (+) |
ИФА, (снижение уровня антигена), % |
Внесение КП №30 за 24 ч до инфицирования клеток |
||||
Контроль клеток |
91 |
2600 |
0 |
- |
Контроль вируса |
39 |
833 |
4,0 |
- |
КП №30 1:400 |
80 |
2333 |
0 |
96,6 |
КП №30 1:800 |
76 |
2000 |
3,0 |
62,0 |
КП №30 1:1600 |
68 |
1399 |
3,5 |
9,8 |
Внесение КП №30 одновременно с инфицированием клеток |
||||
Контроль клеток |
91 |
2600 |
0 |
- |
Контроль вируса |
35 |
533 |
4,0 |
- |
КП №30 1:400 |
79 |
2400 |
0,25 |
39,7 |
КП №30 1:800 |
76 |
2000 |
0,75 |
16,5 |
КП №30 1:1600 |
71 |
2133 |
1,25 |
17,1 |
Внесение КП №30 через 24 ч после инфицирования клеток |
||||
Контроль клеток |
91 |
2600 |
0 |
- |
Контроль вируса |
31 |
<300 |
4,0 |
- |
КП №30 1:400 |
63 |
1833 |
1,0 |
70,3 |
КП №30 1:800 |
57 |
1699 |
2,5 |
13,3 |
КП №30 1:1600 |
45 |
733 |
3,0 |
13,3 |
Таким образом, КП №30 в разведениях 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600 обладают противовирусным действием при всех схемах его введения: профилактической – за 24 ч до инфицирования, при одновременном введении КП №30 и вируса, а также при внесении КП №30 в культуру клеток через 24 ч после их заражения. Однако, при профилактическом введении КП №30 снижение уровня антигена вируса в культуральной жидкости более выражено и 96,6 %-эффективная концентрация соответствует разведению препарата 1:400 при его внесении за 24 часа до инфицирования клеток вируса иммунодефицита человека. При внесении препарата после инфицирования клеток 70,3 %-ингибирующая концентрация капель Плетнева №30 соответствует его разведению 1:400.
При изучении вирулицидного действия КП №30 на ВИЧ образец вируса обрабатывали КП №30 при 25°С. Лимфобластные клетки человека МТ-4 инфицировали образцами вируса, прошедшего обработку, и контрольными образцами. Инкубировали при 37° С в течение 5-7 дней. Затем учитывали результаты при помощи световой микроскопии – исследование ЦПД.
15-минутный контакт КП №30 в разведениях 1:200-1:3200 с ВИЧ недостаточен для его инактивации. Результаты исследований вирулицидной активности КП №30 представлены в таблице 4.
Таблица 4
Результаты исследования вирулицидной активности КП №30 (контакт препарата с внеклеточным, а затем инфицирование клеток)
Препарат |
Разведение |
Степень ингибирования, log10 ТЦД50 |
15-минутный контакт |
||
КП №30 |
1:200 |
0 |
1:400 |
0 |
|
1:800 |
0 |
|
1:1600 |
0 |
|
1:3200 |
0 |
|
60-минутный контакт |
||
КП №30 |
1:1 |
5,0 |
1:200 |
1,0 |
|
1:400 |
0 |
|
24-часовой контакт |
||
КП №30 |
1:200 |
7,0 |
1:400 |
5,0 |
|
1:800 |
4,0 |
Таким образом, при 60-минутной экспозиции КП №30 в разведении 1:1 с вирусом снижается инфекционный титр вируса на 5,0 lg ТЦД50, что соответствует инактивации вируса на 99,999 %. При 24-часовой экспозиции КП №30 в разведениях 1:200, 1:400 и 1:800 с вирусом снижается инфекционный титр вируса на 7,0 lg, 5,0 lg и 4,0 lg ТЦД50 соответственно.
Заключение
Большой практический интерес представляло изучение противовирусного действия капель Плетнева №30 в отношении вируса иммунодефицита человека. В результате проведенных исследований установлено, что в диапазоне испытанных разведений 1:10-1:100 капли Плетнева №30 оказывают выраженное цитотоксическое действие на лимфобластные Т-клетки в культуре, вызывая их гибель. Эффект заметно снижается начиная с разведений 1:200. 50 %-ингибирующая концентрация препарата составляет 1:250.
Капли Плетнева №30 в разведениях 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600 обладают противовирусным действием при всех схемах его введения: профилактической – за 24 ч до инфицирования, при одновременном введении препарата №30 и вируса, а также при внесении капель Плетнева №30 в культуру клеток через 24 ч после их заражения.
При профилактическом введении капель Плетнева №30 снижение уровня антигена вируса в культуральной жидкости более выражено и 96,6 %-эффективная концентрация соответствует разведению препарата 1:400 при его внесении за 24 часа до инфицирования клеток вируса иммунодефицита человека. При внесении препарата после инфицирования клеток 70,3 %-ингибирующая концентрация капель Плетнева №30 соответствует его разведению 1:400.
Экспозиция исходного раствора капель Плетнева №30 в разведении 1:1 с ВИЧ в течение 60 минут приводит к снижению инфекционного титра вируса на 5,0 lg ТЦД50, что соответствует инактивации вируса на 99,999 %. При 24-часовой экспозиции капель Плетнева №30 в разведениях 1:200, 1:400 и 1:800 с вирусом снижается инфекционный титр вируса на 7,0 lg, 5,0 lg и 4,0 lg ТЦД50 соответственно.
В результате проведенных исследований установлено, что капли Плетнева №30 проявляют противовирусную активность в экспериментах in vitro в отношении вируса иммунодефицита человека. Эффективность противовирусного действия капель Плетнева №30 зависит от способа его применения (профилактически до заражения, с лечебной целью), концентрации и длительности экспозиции.
Список литературы Исследование противовирусного действия капель Плетнева №30 (селефоклитен) на вирус иммунодефицита человека
- Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - М.: Гриф и К. - 2012. - 944 с
- Плетнев В.В. Капли Плетнева для восстановления метаболизма и энергообеспечения тканей и органов. Патент РФ на изобретение №2466734, 2011