Исследование различий ИК-спектров дождевых червей как возможный способ их таксономической идентификации

Дождевые черви являются ключевыми “инженерами”, управляющими рядом экосистемных функций почвы, такими как круговорот питательных веществ [Lavelle et al., 2016], разложение опада [Blouin et al., 2013] и эмиссия парниковых газов [Lubbers et al., 2013]. Чтобы оценить влияние дождевых червей на обеспечение этих функций, необходима их таксономическая идентификация, которая традиционно основана на морфологических особенностях, однако она трудоемка и требует определенной квалификации. А определение неполовозрелых и поврежденных особей часто невозможно, из-за чего они не используются в исследованиях [Richard et al., 2010]. Поэтому молекулярные подходы, такие, как анализ ДНК, стали использоваться как альтернативный инструмент для идентификации дождевых червей [Shekhovtsov et al., 2017] или разделения морфологически схожих видов [Shekhovtsov et al., 2016]. Несмотря на технологическое развитие и снижение стоимости оборудования и реактивов для проведения секвенирования [Gautier et al., 2018; Srivathsan et al., 2019], анализ ДНК редко применяется в исследованиях из-за высокой стоимости, поэтому существует необходимость использовать недорогие и доступные методы идентификации таксонов (видов) дождевых червей с помощью более дешевых альтернативных молекулярных подходов [Vaupel, Hommel, Beule, 2022] или метаболомики, которая основана на методах аналитической химии, анализирующей глобальный метаболический профиль объекта [Rodríguez-Fernández et al., 2010]. Одним из самых дешевых, надежных и почти мгновенных методов является инфракрасная (ИК) спектрометрия [Raupach et al., 2016].

Возможности использования ИК-спектрометрии для таксономической идентификации установлены в различных областях [Rodríguez-Fernández et al., 2010; Vance et al., 2016], в том числе для бабочек [Tao et al., 2018], мух дрозофил [Aw, Dowell, Ballard, 2012], прямокрылых [Da Silva, Gutjahr, De Morais, 2018], комаров [Sikulu, 2014], долгоносиков [Johnson, 2022] и термитов [Jouquet et al., 2018]. Поэтому целью данного исследования являлось изучение химического состава тел дождевых червей разных родов и видов методом инфракрасной спектрометрии для установления возможности его использования в таксономической идентификации дождевых червей.

Материал и методы исследования

Сбор дождевых червей

Объектами исследования послужили дождевые черви 7 видов из 5 родов: Aporrectodea caliginosa (Savigny, 1826), Eisenia fetida (Savigny, 1826), Eisenia nordenskioldi (Eisen, 1879), Eisenia ventripapillata Perel, 1985, Lumbricus rubellus Hoffmeister, 1843, Rhiphaeodrilus diplotetrathecus (Perel, 1967), Octolasion lacteum (Orley, 1885). Дождевые черви были собраны на 4 участках: в окрестностях с. Чернолучье (Омский р-н, Омская обл., N 55°16'33.6", Е 73°02'35.3"); на исследовательском полевом стационаре Омского государственного педагогического университета (г. Омск, N 55°02'38.9", Е 73°22'52.4"); на территории Парка культуры и отдыха им. 30-летия Победы (г. Омск, N 54 ° 57', Е 73 ° 21'); в окрестностях д. Хомутов-ки (городской округ Первоуральск, Свердловская обл., N 56°51'37.7", E 59°46'02.8").

Инкубационный эксперимент. Подготовка образцов

Для изучения состава тела дождевых червей мы поместили их в 14 двухлитровых пластиковых контейнеров с перфорированными крышками, по два микрокосма на каждый вид. Микрокосмы были заполнены 1.5 л почвы, очищенной от макрофауны с помощью сит с диаметром ячейки 4 мм. Во всех микрокосмах в качестве подстилки использовалась сухая листва Populus tremula L. по 9.00 ± 0.05 г. Таким образом мы нивелировали влияние типа почвы и опада на состав тела червей. Почву в микрокосмах поли- вали одинаковым количеством дистиллированной воды, чтобы поддерживать влажность на уровне 50%. В каждый микрокосм добавляли по 8 особей дождевых червей. В микрокосмах дождевые черви содержались в течение 90 сут., и каждые 30 дней производилась замена почвы. Затем их промывали дистиллированной водой. Для очистки кишечника содержали пять суток в отдельных контейнерах по 2 особи на фильтровальной бумаге, которую меняли по мере загрязнения. После этого их замораживали на 24 ч., заранее удалив последние сегменты тела, так как они часто содержали остатки почвы. Далее червей высушивали при температуре 60°C в течение 48 ч. и потом измельчали в порошок. Всего было подготовлено по 6 образцов каждого вида по 2–3 особи на один образец.

Метод получения и предварительной обработки ИК-спектров

Порошки исследовали в таблетках, спрессованных в смеси с бромистым калием (соотношение 1:100, диаметр 3.5 мм). В качестве опорного использован спектр чистого бромистого калия, предварительного высушенного при температуре ~600°С в течение 6 ч. ИК-спектры поглощения регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре «ФТ-801» (СИМЕКС) в диапазоне 500–4000 см–1 (число сканов 32, разрешение 4 см– 1). Коррекция базовой линии и нормализация спектров произведены с использованием программного обеспечения ZaIR 3.5 (СИМЭКС). На всех спектрах определяли положение, интенсивность и площадь полос поглощения (ПП).

Статистический анализ полученных данных выполнен при помощи программ Statistica 10.0 (StatSoft) непараметрическим методом с использованием в зависимых группах критерия Вилкоксона, в независимых группах – U-критерия Манна-Уитни. Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 25-го и 75-го процентилей [LQ; UQ]. Различия считали статистически значимыми при p ˂0.05. Для определения видовой близости состава тела дождевых червей использовали метод Уорда для построения кластерной древовидной диаграммы с евклидовой мерой сходства. Анализ методом главных компонент (PCA) был выполнен в программном пакете R (package “FactoMinerR”) [Le, Josse, Husson, 2008].

Результаты и их обсуждение

Типичный ИК-спектр червя приведен на рис. 1. Показано, что в его структуре присутствуют функциональные группы белков (1 315–1 638 см^–1), липидов (2 873–2 960 см^–1) и нуклеиновых кислот (617–1 233 см^–1). Детальная расшифровка ИК-спектров приведена в табл. 1. В целом по функционально-групповому составу исследуемые виды близки, основные отличия наблюдаются для ПП 617 см^–1, 1 053–1 080 см^–1 и 1 619–1 638 см^–1 (рис. 2). ПП 1 053 см^–1, которая появляется дополнительно на ИК спектрах червей вида R. diplotetrathecus и E. ventripapillata, соответствует колебаниям νC-O и δC-O углеводов. Некоторая сходность исследуемых видов по функционально-групповому составу может быть объяснена сходством среды обитания, так как червей перед анализом содержали 90 дней в лабораторных условиях в одинаковой почве и на одинаковой подстилке для нивелирования разницы в контрастности условий обитания, так как ранее для термитов [Jouquet et al., 2018] и дождевых червей [Pham et al., 2021] была установлена зависимость функционально-группового состава ИК-спектров от среды обитания и типа почвы. В то же время копролиты дождевого червя Andiodrilus pachoensis (Michaelsen, 1900) существенно различались по характеристикам ИК-спектров в зависимости от расположения участка и состава растительного покрова [Velasquez et al., 2007].

Рис. 1. Типичный ИК-спектр дождевого червя [Typical IR-spectrum of an earthworm]

Таблица 1

Основные ПП на ИК-спектрах дождевых червей [Main absorption bands in the IR spectra of earthworms]

ПП, см-1	Расшифровка	ПП, см–1	Расшифровка
617	Кольцевая деформация фенила	1 542	δN-H, νC-N (Амид II)
929	Левосторонняя спираль ДНК (Z-форма)	1 619	νC=O (Амид I) β-pleated sheets
1 080	νPO 2 (коллаген и фосфоди-эфирные группы нуклеиновых кислот)	1 638	νC=O (Амид I) α-helical protein
1 170 (1 156)	νC-O of proteins and carbohydrates	2 873	ν s CH 3 (липиды)
1 233	δN-H, νC-N (Амид III) ν as PO 2 (нуклеиновые кислоты)	2 929	ν as CH 2 (липиды)
1 315	Амид III (белки, коллаген)	2 960	ν as CH 3 (липиды, ДНК, белки)
1 341	CH 2 wagging (коллаген)	3 415	Stretching O-H asymmetric
1 403	νC-N, δN-H, δC-H	3 472	Stretching O-H asymmetric
1 455	δ as CH 3 , δCH 2	3 548	Stretching O-H

Рис. 2. Примеры ИК-спектров разных видов дождевых червей [Examples of IR spectra of different species of earthworms]

Выявлено, что частота встречаемости ПП на ИК-спектрах червей различных видов неодинакова (табл. 2). Так, ПП 930 и 1338 см^–1 не обнаружены для вида L. rubellus , ПП 1355 см^–1 для вида E. ventripapillata . ПП 1053 см^–1 характерна для видов R. diplotetrathecus и E. ventripapillata и т.д. (табл. 2). В исследовании Фама с соавторами [Pham et al., 2021] виды червей Lumbricus terrestris Linnaeus, 1758, Allolobophora chlorotica (Savigny, 1826), A. caliginosa и Aporrectodea icterica (Savigny, 1826) также различались между собой по полосам поглощения в основном в областях 3 500–3 000 и <1 800 см^-1.

Таблица 2

Частота встречаемости ПП на ИК-спектрах дождевых червей различных видов

[Frequency of occurrence of absorption bands in the IR spectra of earthworms of different species]

ПП, см-1	A. caliginosa	E. fetida	E. nordenskioldi	L. rubellus	R. diplotetrathecus	O. lacteum	E. ventripapillata
614	100	50	33	67	100	100	50
930	33	100	100	0	100	100	100
1053	0	0	0	0	100	0	100
1080	100	100	100	100	100	100	100
1156	100	100	100	100	100	100	100
1236	100	100	100	100	100	100	100
1315	100	100	50	100	100	100	100
1338	100	100	33	0	67	33	83
1355	33	100	83	50	50	67	0
1407	100	100	100	100	100	100	100
1455	100	100	100	100	100	100	100
1547	100	100	100	100	100	100	100
1620	33	50	0	0	33	33	0
1640	100	100	100	100	100	100	100
2874	67	0	0	0	50	67	50
2929	100	100	100	100	100	100	100
2960	100	100	100	100	100	100	100
3418	100	50	33	100	100	100	100
3469	33	33	0	0	17	0	0
3546	83	17	0	0	17	0	0

Характеристики ПП, которые идентифицированы на ИК-спектрах всех изученных видов дождевых червей, приведены в открытом доступе на Figshare по адресу

С целью выявления сходств и различий между ИК спектрами разных видов червей проведен кластерный анализ (рис. 3).

Рис. 3. Результаты кластерного анализа

[Results of cluster analysis]

Только для вида A. caliginosa отмечено попадание в разные кластеры, остальные виды показали четкое разделение: A. caliginosa + O. lacteum (кластер 1), R. diplotetrathecus + E. ventripapillata (кластер 2), E. fetida + E. nordenskioldi + L. rubellus (кластер 3) (рис.3). При укрупненном рассмотрении все виды кластеров 1 и 2 формируют единый кластер (кластер 1*).

Разделение дождевых червей на кластеры (рис. 3 и рис. 4) может быть объяснено несколькими причинами: их происхождением, родством и влиянием среды. A. caliginosa и O. lacteum являются европейскими по происхождению дождевыми червями, которые обитают и питаются непосредственно в почве [Tiunov et al., 2006]. E. fetida и E. nordenskioldi – филогенентически близкие друг к другу виды [Latif, Malek, Csuzdi, 2017], а некоторая их обособленность может быть вызвана разницей в происхождении. Согласно данным C. Csuzdi, J. Koo, Y. Hong [2022] род Eisenia формирует два субклада: один европейский, куда входит E. fetida , другой состоит из азиатских таксонов, включая E. nordenskioldi . Поэтому объединение этих четырех видов в два кластера видится закономерным. Попадание L. rubellus в кластер к E. fetida + E. nordenskioldi можно объяснить активным потреблением опада осины всеми тремя видами.

Объединение двух горных эндемиков R. diplotetrathecus [Перель, 1979; Vorobeichik et al., 2021] и E. ventripapillata [Перель, 1985] в один кластер можно объяснить сходными условиями обитания в горной местности при формировании видовых особенностей.

Попадание A. caliginosa (рис. 3) в два разных кластера может быть обусловлено тем, что некоторые особи могли потреблять больше подстилки, чем другие, так как отмечена его способность переходить к активному потреблению подстилки в лабораторных условиях, подобно подстилочным видам [van Groenigen et al., 2019].

Близкие результаты получены при многомерной оценке полученных данных методом главных компонент (РСА) (рис. 4).

■ 5                   0                   5                       -1.0         -0.5         0.0          0.5          1.0

Рис. 4. Факторные карты образцов (А) и переменных (Б).

A1 – X 617, A2 – H 617, A3 – S 617, A4 – X 1080, A5 – H 1080, A6 – S 1080, A7 – X 1156, A8 – H 1156, A9 – S 1156, A10 – X 1236, A11 – H 1236, A12 – S 1236, A13 – X 1315, A14 – H 1315, A15 – S 1315, A16 – X 1407, A17 – H 1407, A18 – S 1407, A19 – X 1455, A 20 – H 1455, A21 – S 1455, A22 – X 1547, A23 – H 1547, A24 – S 1547, A25 – X 1640, A26 – H 1640, A27 – S 1640, A28 – Х 2929, A29 – H 2929, A30 – S 2929, A31 – X 2960, A32 – H 2960, A33 – S 2960, A34 – X 3418, A35 – H 3418, A36 – S 3418. Х – положение ПП, H – высота ПП, S – площадь ПП

[Factor map of samples (A) and factor map of variables (Б). X is the position of the absorption band, H is the height of the absorption band, S is the area of the absorption band]

Показано, что вся выборка разделяется на 3 подгруппы: A. caliginosa + O. lacteum, R. diplotetrathecus + E. ventripapillata, E. fetida + E. nordenskioldi + L. rubellus (рис. 4а). Первые два компонента выражают 52.66% общей инерции набора данных. Первая главная компонента разделяет группы относительно вертикальной оси, вторая главная компонента – относительно горизонтальной оси. Вклад характеристик ИК-спектров в разделение подгрупп показан в табл. 3. Максимальный вклад в разделение подгрупп A. caliginosa + O. lacteum и R. diplotetrathecus + E. ventripapillata от E. fetida + E. nordenskioldi + L. rubellus вносят ПП 2960, 2929, 1547, 1455, 1407, 1355 и 1236 см–1, при этом положительные коэффициенты кор- реляции отмечены с высотой и площадью соответствующих ПП, тогда как отрицательные – с положением ПП (табл. 3).

Таблица 3

Коэффициенты корреляции характеристик ПП [Correlation coefficients of characteristics of absorption bands]

РС1			РС2
Характерис тика ПП		Коэффициент корреляции	Характеристика ПП		Коэффициент корреляции
А32	H 2960	0.9384	А6	S 1080	0.8095
А20	H 1455	0.9047	А5	H 1080	0.7742
А21	S 1455	0.8819	А4	X 1080	0.7520
А12	S 1236	0.8517	А31	X 2960	0.7473
А33	S 2960	0.7870	А28	Х 2929	0.6979
А11	H 1236	0.7864	А7	X 1156	0.5804
А30	S 2929	0.7801	А14	H 1315	0.5294
А29	H 2929	0.7552	А15	S 1315	0.5205
А24	S 1547	0.7150	А3	S 617	–0.5285
А23	H 1547	0.6954	А29	H 2929	–0.5632
А15	S 1315	0.6498	А30	S 2929	–0.5786
А14	H 1315	0.5625	А13	X 1315	–0.5805
А31	X 2960	–0.5385	А9	S 1156	–0.8805
А10	X 1236	–0.6526	А8	H 1156	–0.9128
А22	X 1547	–0.6858	А16	X 1407	–0.8610

Максимальный вклад в разделение вносят характеристики ПП валентных и деформационных колебаний метильных и метиленовых групп в структуре червей (2 960, 2 929 и 1 455 см^–1) и амидных групп (1 547, 1 407, 1 315 и 1 236 см^–1). Разделение подгрупп A. caliginosa + O. lacteum E. fetida + E. nordenskioldi + L. rubellus и от R. diplotetrathecus + E. ventripapillata определяется ПП 2 960, 2 929, 1 315, 1 156, 1 080 и 617 см^–1, причем здесь отмечена противоположная тенденция: положительные коэффициенты корреляции выявлены для положения ПП, отрицательные – для высот и площадей ПП. Помимо ПП валентных и деформационных колебаний метильных и метиленовых групп в разделение вносят вклад ПП коллагена и фосфодиэфирных групп нуклеиновых кислот (1 156, 1 080 и 617 см^–1).

Можно было предположить, что дождевые черви могли бы разделиться согласно принадлежности к экологическим группам в соответствии с классификацией экологических категорий Буше [Bouche, 1972], как это произошло в исследовании Фама с соавторами [Pham et al., 2021], когда эпианекический L. terrestris был отделен от двух эндогейных видов ( A. caliginosa и A. icterica ) и промежуточного вида A. chlorotica по первой дискриминантной функции. В нашем исследовании такого разделения закономерно не произошло (см. рис. 4), так как при разработке экологической классификации дождевых червей Буше учитывал морфо-анатомические признаки и экологию [Botinelli et al., 2020] и не учитывал сложный химический состав тела. Таким же образом, экологические категории не отражают влияния дождевых червей на показатели почвы [van Groenigen et al., 2019; Bottinelli, Capowiez, 2021] или же состав производимых ими копролитов [Babiy et al., 2021].

Заключение

В настоящем исследовании показана принципиальная возможность таксономической идентификации дождевых червей на основании изучения функционально-группового состава их тел методом ИК-Фурье спектроскопии. Основные отличия наблюдаются для ПП 617 см–1, 1 053–1 080 см–1 и 1 619–1 638 см–1. ПП 1 053 см–1, которая появляется дополнительно на ИК-спектрах червей видов R. diplotetrathecus и E. ventripapillata, соответствует колебаниям νC-O и δC-O углеводов. При этом для увеличения точности определения видовой принадлежности данным методом необходимо выявить специфические особенности для каждого вида дождевого червя, что планируется сделать на следующем этапе исследования. Для достижения этой цели имеет смысл увеличить размер выборки для получения более точных маркерных характеристик. При этом, возможно, стоит анализировать червей с разных почв и на разных подстилках, чтобы получить надежные маркеры. Другой возможный вариант предполагает выявление специфической части тела дождевого червя, анализ которой даст более четкие видовые признаки и не потребует анализа всего дождевого червя в целом. Например, если функционально-групповой состав кожно-мускульного мешка будет более видоспецифичным, то это позволит улучшить качество таксономической идентификации.