Исследование редких видов пшениц как доноров для селекции на содержание антоцианов в зерне

Мягкая пшеница ( Triticum aestivum L., 2 n = 6 ½ = 42, AABBDD) служит источником углеводов, белков, пищевых волокон, минеральных веществ и различных фенольных соединений. Среди них выделяют антоцианы, которые все чаще рассматриваются в качестве компонентов функциональных продуктов питания (1, 2).

Антоцианы представляют собой водорастворимые окрашенные гликозиды, содержащие в качестве агликона антоцианидины — замещенные 2-фенилхромены. На основании наличия гидроки- и метокси-групп в положениях 3´ и 5´ молекулы агликона выделяют шесть основных антоцианидинов: цианидин, дельфинидин, мальвидин, пеларгонидин, пеонидин и пе-тунидин. Дополнительные модификации этих агликонов, среди которых наиболее распространены гликозилирование, метилирование и ацилирование ароматическими и алифатическими кислотами, определяют разнообразие антоцианов, насчитывающее более 500 индивидуальных соединений (3).

В зависимости от типа и места локализации антоцианов в зерновке зерно пшеницы может иметь фиолетовую, голубую или темно-фиолетовую окраску. Фиолетовая окраска обусловлена синтезом антоцианов в перикарпе, где преобладает цианидин-3-гликозид. Голубая окраска связана с накоплением антоцианов в алейроновом слое зерна с преобладанием дель-фининдин-3-гликозида. Темно-фиолетовую окраску имеет зерно, накапливающее антоцианы и в перикарпе, и в алейроновом слое; такое зерно характеризуется широким спектром антоциановых соединений, среди которых преобладают цианидин-3-гликозид и дельфининдин-3-гликозид (4-6). Зерно, содержащее антоцианы, имеет более разнообразный состав флавоноидов. Кроме того, оно содержит больше белка и незаменимых аминокислот, макро- и микроэлементов, витаминов по сравнению с зерном, не содержащим антоциановые соединения (7-10). Окрашенное антоцианами зерно пшеницы используют для производства продуктов питания функционального назначения, таких как цельнозерновой хлеб, хлебобулочные и макаронные изделия, каши, печенье, бисквиты, крекеры (11-13). В настоящее время во всем мире, в том числе в Российской Федерации, активно осуществляются селекционные программы по созданию сортов пшеницы, накапливающих антоцианы в зерне (2, 14-16). В России прошли конкурсное сортоиспытание и включены в реестр селекционных достижений три фиолетовозерных сорта мягкой пшеницы: Надира (17), Памяти Коновалова (18) и Эф 22 (19).

Ввиду возросшего интереса к повышению пищевой ценности возделываемых сортов пшеницы за счет увеличения содержания антоцианов в зерне, поиск доноров генов, контролирующих их накопление, считается актуальной задачей.

Среди генов, контролирующих синтез антоцианов, выделяют структурные, кодирующие ферменты метаболического пути, и регуляторные, кодирующие факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию структурных генов. Транскрипционные факторы, принадлежащие семействам R2R3-MYB, bHLH и WD40, регулируют синтез антоцианов, объединяясь в MBW-комплексы (20). Показано, что именно вариабельность регуляторных генов обусловливает различные паттерны пигментации у растений (21).

У мягкой пшеницы накопление антоцианов в перикарпе зерновки, приводящее к фиолетовой окраске зерна, контролируется двумя комплементарными генами Pp (Purple pericarp): геном Pp3, картированным на хромосоме 2A, и одним из гомеологичных генов Pp-1, картированных на коротких плечах хромосом 7-й гомеологической группы (22).

С помощью метода позиционного клонирования из генома мягкой пшеницы была выделена нуклеотидная последовательность гена Pp3 (синонимичные названия TaMyc1 , TaPpb1 ), кодирующего транскрипционный фактор с доменом bHLH (23). В промоторе этого гена у окрашенных генотипов были выявлены шесть тандемных повторов каждый длиной 261 нуклеотид (аллель TaMyc1p ), тогда как у неокрашенных сортов присутствовал один такой повтор ( TaMyc1w ) (24, 25). Обнаруженные различия послужили основой для разработки диагностического ДНК-маркера, который используется в настоящее время в селекции фиолетовозерных сортов пшеницы (26-28).

Второй комплементарный ген Pp-1 , необходимый для формирования признака фиолетовой окраски зерна, был картирован в составе кластера генов, включающего Ra ( Red auricles ), Rc ( Red coleoptile ), Pan ( Purple anthers ), Pc ( Purple culm ), Pg ( Purple glume ), Pls ( Purple leaf sheath ), на коротких плечах хромосом 7-й гомеологической группы. Выявленный кластер ко-локализу-ется с геном Mpc1 (R2R3-MYB protein C1), ортологичным гену C1 кукурузы. Последний кодирует регуляторный фактор с доменом R2R3-MYB и контролирует у кукурузы окраску вегетативных органов (22).

Позднее были выделены нуклеотидные последовательности гена TaC1 , контролирующего окраску колеоптиля у пшеницы (29). Было показано участие гена TaC1 (синонимы Pp-1 , TaPpm1 , TaMpc1 ) в окраске перикарпа зерна пшеницы (24). Таким образом, второй ген, необходимый для формирования окраски зерна, имеет плейотропный эффект в отношении пигментации колеоптиля у пшеницы. Ряд авторов отмечают, что окраска колеоптиля, стебля, листовых влагалищ и узлов стебля наследуется совместно (30), что подразумевает участие генов Pp-1 в окраске не только колеоптиля, но и органов взрослого растения.

У пшеницы были выявлены мутаций каждого из гомеологичных генов TaC1 , приводящие к отсутствию пигментации, среди которых инсер-ции, в том числе протяженные (более 1 тыс. нуклеотидов), делеция и замена в кодирующей области гена и в интроне (24, 29). Присутствие трех гомео-логичных генов в рецессивном нефункциональном состоянии обусловливает отсутствие окраски колеоптиля, тогда как наличие хотя бы одной из копий гена в доминантном состоянии приводит к формированию красной окраски колеоптиля.

Голубая окраска алейрона, обусловленная антоциановыми пигментами, контролируется генами Ba ( Blue aleurone ), которые были унаследованы мягкой пшеницей от близкородственных видов T. monococcum , T. bo-eoticum , Thynopirum ponticum (син. Agropyron elongatum ), Th. bessarabicum в процессе межвидовой гибридизации (31). В геноме голубозерной пшеницы, несущей интрогрессию от Th. ponticum , выявлена нуклеотидная последовательность гена Ba1 — ThMyc4E , кодирующего транскрипционный фактор с доменом bHLH; показано ее участие в регуляции синтеза антоцианов в алейроне (32). Ортологичная ей последовательность TbMyc4A , дифференциально экспрессирующаяся в голубом зерне при сравнении с белым, обнаружена в геноме T. boeoticum — донора гена Ba2 (33).

Химически близкие антоцианам полимерные проантоцианидины накапливаются в оболочке зерна и придают ему красную окраску. Гены R-1, контролирующие синтез этих соединений, были картированы на длинных плечах хромосом 3-й гомеологической группы. Показано, что они кодируют транскрипционные факторы с доменом R2R3-MYB, активирующим транскрипцию структурных генов биосинтеза флавоноидов в оболочке зерна пшеницы (34).

Донорами генов, контролирующих окраску зерновки, могут быть редкие виды пшениц, которые рассматриваются также как источники хозяйственно ценных признаков для селекции. В частности, среди образцов T. monococcum , T. dicoccum , T. timopheevii , T. macha , и T. persicum из коллекции ВИР (Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова) выявлены образцы с групповой устойчивостью к возбудителям бурой и желтой ржавчины, пиренофороза, септориоза (35). Наличие у образцов редких видов пшениц генов, контролирующих окраску зерновки, позволит более эффективно использовать их в селекционных исследованиях.

В настоящей работе впервые с помощью комплексного анализа паттернов антоциановой пигментации вегетативных органов и зерна у редких видов пшениц из коллекции ВИР выявлены доноры доминантных аллелей генов Ba , Pp-1 и Pp3 , контролирующих синтез антоцианов, а также проведена оценка устойчивости этих образцов к грибным болезням.

Целью работы было исследование редких видов пшеницы на наличие антоциановой окраски зерна и вегетативных органов, выявление доноров доминантных аллелей генов Ba , Pp-1 и Pp3 , ее контролирующих, а также оценка потенциальных доноров на устойчивость к грибным болезням.

Методика. Проявления антоциановой окраски зерна исследовали у 16 редких видов пшеницы из коллекции ВИР, для 9 из которых также провели оценку окраски вегетативных органов. Были изучены следующие виды: однозернянки T. urartu Thum. ex Gandil ( n = 68), T. boeoticum Boiss. ( n = 99), T. monococcum L. ( n = 113); полбы T. dicoccoides (Korn. ex Aschers. et Graebn.) Schweinf. ( n = 256), T. dicoccum (Schrank) Schuebl. ( n = 502), T. araraticum Jakubz. ( n = 42), T. timopheevii Zhuk. ( n = 45); голозерные тетраплоиды T. aethiopicum Jakubz. ( n = 246), T. persicum Vav. ( n = 140), T. polonicum L. ( n = 61), T. turanicum Jakubz. ( n = 38), T. turgidum L. ( n = 421); спельты T. spelta L. ( n = 231), T. macha Dekapr. et Menabde ( n = 37); голозерные гексаплоиды T. compactum Host. ( n = 616), T. sphaerococcum Perciv. ( n = 54). Всего было проанализировано 2969 образцов.

Наличие антоциановой окраски колеоптиля оценивали у 5-7-суточных проростков, пророщенных на чашках Петри при комнатной температуре и естественном освещении (Дагестанская опытная станция ВИР, 41,98 ° N, 48,33 ° E) (37) в 2019-2021 годах. Для каждого образца, отобранного для анализа окраски вегетативных органов, проращивали по 30 зерен. Образец считался окрашенным даже при наличии слабой антоциановой пигментации.

Окраску листового влагалища, узла соломины и ушек листовой пластинки оценивали в полевых условиях также на Дагестанской опытной станции ВИР в 2019-2021 годах. Каждый образец высевали на делянках площадью 1 м2 по шесть рядков, по 50-60 растений в рядке. Цвет листового влагалища определяли в межфазный период выход в трубку—колошение, окраску влагалищ оценивали у трех нижних листьев, цвет ушек и стеблевых узлов отмечали в фазу колошения, просматривая минимум 10 растений. Оценку антоциановой пигментации вегетативных органов у каждого из исследуемых образцов в полевых условиях проводили однократно.

Для генотипирования ДНК из изучаемой коллекции пшеницы были отобраны 65 образцов, среди которых 22 образца T. boeoticum (17 образцов 958

с голубой и 5 — с красной окраской зерна), 3 образца T. durum (с фиолетовой, белой и красной окраской зерна), 8 образцов T. spelta (2 образца с голубой, 3 — с белой и 3 — с красной окраской зерна) и 32 образца T. aethio-picum (23 образца с фиолетовой, 1 — с белой и 8 — с красной окраской зерна).

ДНК выделяли из молодых листьев пяти растений каждого образца согласно ранее описанной методике (38). Этот этап работы проводили в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН в 2021-2024 годах. Качество и количество выделенной ДНК оценивали методом аналитического электрофореза с маркером длины 100 bp (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН», Россия). Выделенную ДНК анализировали с помощью ПЦР с использованием внутригенных маркеров Pp3-diagnostic и ThMyc4E-specific, разработанных для генов биосинтеза антоцианов соответственно Pp3 и Ba1 : Маркер    Хромосома            Праймеры           Размер продуктов ПЦР, п.н

Pp3-diagnostic       2A    5´-AAGAAATGACACTTCGCCACAA-3´            429/398

5´- GGTGGGCTCTTCCTGGCAT-3´

ThMyc4E-specific    4Th    5´-GAAACAACAGGACCGAGCAG-3´              198/-

5´-CTTGATGGCGTCAAACACTT-3´

ПЦР проводили согласно описанному протоколу (27). Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала до 100 нг ДНК-матрицы, 67 мM Трис-НСl (рН 8,8), 1,8 мM МgCl 2 , 0,01 % Tween 20, 18 мM (NH 4 ) 2 SO 4 , по 0,2 мM каждого дНТФ, по 0,3 мкМ прямого и обратного специфических праймеров, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили в T100 Thermal Cycler («Bio-Rad», США) в следующих условиях: 2 мин при 94 ° С (преденатурация); 15 с при 94 ° С (денатурация), 30 с при 65 ° С с понижением на 0,7 ° С/цикл (отжиг матрицы с праймерами), 45 с при 72 ° C (полимеризация) (13 циклов); 15 с при 94 ° С (денатурация), 30 с при 56 ° С (отжиг матрицы с праймерами), 30 с при 72 ° C (полимеризация) (24 цикла); 5 мин при 72 ° С (достраивание ПЦР-фрагментов).

Продукты ПЦР разделяли в 2 % агарозном геле (LE Agarose, «Lonza Rockland, Inc.», США) в горизонтальной камере в течение 1-5 ч при 7 Вт/см. Фотографии в УФ-свете и анализ изображения делали с помощью системы документации гелей Molecular Imager® Gel DocTM XR+ System («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). В качестве контроля использовали ДНК образцов с доминантными аллелями генов Ba1 и Pp3 — созданной на основе родительского сорта Саратовская 29 (S29) пшенично-пырейной замещенной линии s:S29 Ba1 4Th(4D), несущей вместо хромосомы 4D пшеницы хромосому 4Th пырея, где был картирован ген Ba1 , и почти-изогенная линия i:S29 Pp3 ^P Pp-D1 ^P с доминантным аллелем гена Pp3 (27).

Фенологические наблюдения и оценку устойчивости образцов к грибным болезням на естественном инфекционном фоне проводили на Дагестанской опытной станции ВИР в 2017-2018 годах в соответствии с методическими указаниями ВИР (39). Образцы высевали на делянках площадью 1 м2 по шесть рядков, по 50-60 растений в рядке. Устойчивость оценивали по 9-балльной шкале при визуальном осмотре поражений на листьях на протяжении всего вегетационного периода. Максимальный балл получали образцы, на которых не было выявлено поражение болезнью или отмечены единичные пустулы, окруженные некрозом, у единичных растений с делянки. Минимальный балл получали образцы, у которых основная часть растений с делянки имела пораженные болезнью листья.

Результаты. Для поиска потенциальных доноров доминантных аллелей генов Ba и Pp, контролирующих синтез антоцианов соответственно в алейроновом слое и перикарпе зерновок, коллекция редких видов пшениц была проанализирована на наличие пигментации зерна. Выделяли образцы с фиолетовой либо голубой окраской, обусловленной антоцианами, с красной окраской, которая образуется за счет синтеза и последующего окисления проантоцианидинов, и образцы без окраски, у которых был нарушен синтез проантоцианидинов в зерне и не синтезировались антоцианы (табл. 1).

1. Окраска зерна у редких видов пшеницы из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР)

Секция	Группа видов	Вид	2 n	Геном	Окраска зерна				Всего
					Б	К	Ф 7	Г
Urartu Dorof. et A. Filat.	Однозернянки	T. urartu Thum. ex Gandil	14	Au	-	+		-	68
Dicoccoides	Полбы	T. dicoccoides (Körn. ex Aschers. et	28	BAu	-	+	-	-	256
Flaksb.		Graebn.) Schweinf. T. dicoccum (Schrank) Schuebl.	28	BAu	Един.	+	-	-	502
	Голозерные	T. aethiopicum Jakubz.	28	BAu	+	+	+	-	246
	тетраплоиды	T. persicum Vav. (= T. carthlicum Nevski	28	BAu	Един.	+	-	-	140
		T. polonicum L.	28	BAu	+	+	-	-	61
		T. turanicum Jakubz.	28	BAu	+	Един.	-	-	38
		T. turgidum L.	28	BAu	+	+	-	-	421
Triticum	Спельты	T. spelta L.	42	BAuD	+	+	-	Един.	231
		T. macha Dekapr. et Menabde	42	BAuD	-	+	-	-	37
	Голозерные	T. compactum Host.	42	BAuD	+	+	-	-	616
	гексаплоиды	T. sphaerococcum Perciv.	42	BAuD	+	+	-	-	54
Monococcon	Однозернянки	T. boeoticum Boiss.	14	Ab	-	+	-	+	99
Dum.		T. monococcum L.	14	Ab	-	+	-	-	113
Timopheevii	Полбы	T. araraticum Jakubz.	28	GAb	+	+	-	-	42
A. Filat. et Dorof.		T. timopheevii Zhuk.	28	GAb	+	-	-	-	45

Примечани е. Б — белая, К — красная, Ф — фиолетовая, Г — голубая. « +» — наличие образцов с указанной окраской зерна, « - » — отсутствие образцов с указанной окраской зерна, един. — единичные образцы с указанной окраской зерна. Классификация видов пшениц по Н.П. Гончарову (36).

Среди диплоидных видов пшеницы зерно голубого цвета, окрашенное антоцианами, выявили лишь у образцов T. boeoticum , тогда как для T. monococcum и T. urartu была характерна красная окраска зерна, образцов с белой окраской мы не обнаружили.

Большинство тетраплоидных видов пшеницы имели красную окраску зерновки. У T. turanicum выявляли единичные образцы с красной окраской, тогда как большинство образцов этого вида имели белое зерно. У всех проанализированных образцов T. timopheevii зерно оказалось не окрашено. У тетраплоидных видов пшениц не были обнаружены образцы с голубым зерном. Фиолетовая окраска зерна наблюдалась у ряда образцов T. aethiopicum , у T. aethiopicum также были выявлены образцы с красной и белой окраской зерновки.

Все проанализированные гексаплоидные виды пшениц были представлены краснозерными и белозерными образцами. Лишь у T. spelta два образца имели голубую окраску зерновки.

У всех образцов T. boeoticum вне зависимости от их окраски в ПЦР с маркером ThMyc4E-specific амплифицировались фрагменты длиной 198 п.н., совпадающие по размеру с ПЦР-фрагментами, получаемыми с помощью этого маркера в случае пшенично-пырейной замещенной линии s:S29 Ba1 4Th(4D) (рис. 1, А). Используя маркер ThMyc4E-specific, мы не получили ПЦР-фрагменты на матрице ДНК образцов T. durum и T. aethiopicum , за исключением некоторых образцов, где ПЦР-фрагменты, сходные по длине с целевым ПЦР-продуктом, присутствовали в следовых количествах. Это указывает на частичную амплификацию ортологичных последовательностей ДНК, однако интенсивность амплификации была значительно снижена по сравнению с контрольным образцом s:S29 Ba1 4Th(4D) и образцами T. boeoticum .

л

Т. boeotkum                        Т. durum        Т. spelta Кошроли

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28'28-’29129-’30 31 К1К2КЗМ

ГГГГГГГГГ ГГ Г Г Г Г Г Г КККККФБКГГББКККБКГФ

Т. aethiopicum                               Кошроли

М 3233 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 5 I 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 КI К2КЗМ

ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф ф Ф Ф Ф Б К К К К К К К К К Г Ф

Б

Т. boeotkum                        Т. durum        Т. spelta Кошроли

Ml 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728'28’29'29^0 31К1К2КЗМ

ГГГГГГГГГ ГГ Г Г Г Г Г Г КККККФБКГГББКККБКГФ

Т. aethiopicum                              Кошроли

Рис. 1. Электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с использованием молекулярных маркеров ThMyc4E-specific (А) и Pp3-diagnostic (Б) и ДНК образцов Triticum boeoticum (1-22) , T. durum (23-25) , T. spelta (26-31) , T. aethiopicum (32-63) и контрольных образцов T. aestivum сорта Саратовская 29 (К1) , пшенично-пырейной замещенной линии s:S29 Ba1 4Th(4D) (К2) и по-чти-изогенной линии i:S29 Pp3 ^P Pp-D1 ^P (К3): 1 — k-18424 (Крым, Россия), 2 — k-58512 (Армения), 3 — k-58674 (Армения), 4 — k-59173 (Нагорный Карабах, Азербайджан), 5 — k-61036 (Иран), 6 — k-61037 (Иран), 7 — k-61038 (Турция), 8 — k-61039 (Турция), 9 — k-61040 (Иран), 10 — k-61660 (Греция), 11 — k-61666 (Греция), 12 — k-61669 (Турция), 13 — k-64833 (Армения), 14 — k-61673 (Болгария), 15 — k-62492 (Болгария), 16 — k-62495 (Греция), 17 — k-64833 (Армения), 18 — k-58512 (Армения), 19 — k-62492 (Болгария), 20 — k-40117 (Ирак), 21 — k-40119 (Ирак), 22 — k-62495 (Греция); 23 — k-46512 (Чили), 24 — k-17884 (Кипр), 25 — k-54928 (Иран); 26 — k-28321 (Германия до 1949 года), 27 — k-45767 (Чехословакия до 1992 года), по две популяции: 28^{1, 2} — k-52450 (Таджикистан), 29^{1, 2} — k-52459 (Таджикистан) (, 30 — k-63663 (Швейцария), 31 — k-52471 (Таджикистан); 32 — k-624629, 33 — k-624630, 34 — k-624631, 35 — k-624639, 36 — k-624652, 37 — k-624661, 38 — k-624665, 39 — k-624665, 40 — k-624666, 41 — k-624669, 42 — k-624669, 43 — k-624670, 44 — k-624681, 45 — k-624682, 46 – k-624684, 47 — k-624684, 48 — k-624683, 49 — k-624688, 50 — k-624688, 51 — k-624689, 52 — k-624690, 53 — k-624690, 54 — k-19553, 55 — k-19530, 56 — k-624637, 57 — k-624656, 58 — k-624660, 59 — k-624662, 60 — k-19567, 61 — k-19616, 62 — k-21816, 63 — k-43762 (все образцы из Эфиопии). Окраска зерна образца указана снизу: Б — белая, Г — голубая, К — красная, Ф — фиолетовая. Стрелками указаны фрагменты маркера длины 100bp (ООО «Лаборатория МЕ-ДИГЕН», Россия), соответствующие 500 п.н.

Таким обозом, маркер ThMyc4E-specific амплифицировал не только фрагменты гена Ba1 пырея, но также фрагменты гена Ba2 T. boeoticum. При этом различий в размерах ПЦР-фрагментов между окрашенными и неокрашенными образцами установлено не было. При генотипировании с использованием маркера ThMyc4E-specific восьми образцов T. spelta у двух образцов, имеющих голубую окраску зерновки, были получены ПЦР-продукты, тогда как у неокрашенных образцов ПЦР-фрагменты не выявили. Наши результаты указывают на то, что голубозерные образцы несли в геноме либо ген Ba1, унаследованный от пырея, либо ген Ba2 от T. boeoticum.

Все образцы также были генотипированы с помощью ДНК-маркера Pp3-diagnostic, позволяющего отличить доминантный аллель гена Pp3 от рецессивного. Все образцы T. aethiopicum с фиолетовой окраской зерновки имели ПЦР-фрагмент длиной 398 п.н., соответствующий доминантному аллелю гена Pp3, тогда как ПЦР-фрагменты у белозерных и краснозерных образцов T. aethiopicum имели длину 429 п.н., соответствующую рецессивному аллелю гена Pp3 (см. рис. 1, Б) . С использованием маркера Pp3-diagnostic на матрице ДНК образцов T. boeoticum не было получено специфических ПЦР-фрагментов гена Pp3 , а у образцов T. speltа амплифициро-вались фрагменты рецессивного аллеля гена Pp3, за исключением одного образца (¹ 26, см. рис. 1, Б), для которого ПЦР-фрагментов мы не получили. Возможно, у этого образца участок генома был замещен участком генома близкородственного вида, у которого указанный ген отсутствовал. Таким образом, все изученные фиолетовозерные образцы пшеницы — доноры доминантного аллеля гена Pp3, присутствие которого в геноме подтверждено с помощью ПЦР-анализа.

Выявленные образцы с антоциановой пигментацией зерна могут стать перспективными донорами для селекции на содержание антоцианов (табл. 2).

2. Образцы редких видов пшеницы из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР) с антоциановой окраской зерна и их устойчивость к патогенам

¹ по каталогу ВИР Происхождение Вид, разновидность Цвет зерна Устойчивость, балл к мучнистой росе к бурой/жел-той ржавчине k-18424 Крым, Россия Triticum boeoticum var. viridoboeoti-cum, viridisymbolonense Голубой 7 9 k-58512 Армения T. boeoticum var. larionovii, pubescen-tinigrum, symbolonense Голубой 7 9 k-58674 Армения T. boeoticum var. baydaricum, larionovii, mikoianii Голубой н.д. н.д k-59173 Нагорный T. boeoticum var. azerbajdjanicum, Карабах  aznaburticum, chochlovae Голубой 5 9 k-61036 Иран T. boeoticum var. gegadiricum, nigri-chlorococcum, thaoudar, viridifuscum Голубой 7 7 k-61037 Иран T. boeoticum var. chochlovae, gegadiricum Голубой 7 7 k-61038 Турция T.boeoticum var. albinigrescens, bicolor, biarpurunivir, nigrireuteri, rufinigrum, viridifuscum Голубой 9 7 k-61039 Турция T. boeoticum var. abovjanii, born-muelleri, rufinigrum, viridalbum, viridifuscum, viridinigrum Голубой 9 9 k-61040 Иран T. boeoticum var. subbaydaricum, subpantchitchii, viridifuscum Голубой 9 9 k-61660 Греция T. boeoticum var. aznaburticum, kovarskii, viridiboeoticum Голубой 9 9 k-61666 Греция T. boeoticum var. boeoticum, Голубой 7 9 kovarskii, viridiboeoticum

Продолжение таблицы 2

k-61669	Турция	T. boeoticum var. mikoianii , pant-chitchii , pubescentinigrum , rufinigrum	Голубой	9	9
k-64833	Армения	T. boeoticum var. kurbagalense	Голубой	н.д.	н.д
k-28321	Германия до 1949 года	T. spelta var. viridarduini	Голубой	н.д.	н.д
k-45767	Чехословакия до 1992 года	T. spelta var. viridarduini	Голубой	н.д.	н.д
k-624629	Эфиопия	T. aethiopicum var. arraseita	Фиолетовый	1	1
k-624630	Эфиопия	T. aethiopicum var. arraseita	Фиолетовый	3	9
k-624631	Эфиопия	T. aethiopicum var. arraseita	Фиолетовый	3	7
k-624639	Эфиопия	T. aethiopicum var. alboviolaceum	Фиолетовый	5	3
k-624652	Эфиопия	T. aethiopicum var. arraseita	Фиолетовый	3	9
k-624661	Эфиопия	T. aethiopicum var. arraseita	Фиолетовый	5	9
k-624665	Эфиопия	T. aethiopicum var. schimperi	Фиолетовый	7	9
k-624666	Эфиопия	T. aethiopicum var. steudelianum	Фиолетовый	7	9
k-624669	Эфиопия	T. aethiopicum var. densarraseita	Фиолетовый	н.д.	н.д
k-624669	Эфиопия	T. aethiopicum var. arraseita	Фиолетовый	н.д.	н.д
k-624670	Эфиопия	T. aethiopicum var. arraseita	Фиолетовый	3	9
k-624681	Эфиопия	T. aethiopicum var. shweinfurtii	Фиолетовый	5	9
k-624682	Эфиопия	T. aethiopicum var. nigridensischimperi	Фиолетовый	1	9
k-624684	Эфиопия	T. aethiopicum var. nigridensarraseita	Фиолетовый	5	9
k-624684	Эфиопия	T. aethiopicum var. shweinfurtii	Фиолетовый	5	7
k-624683	Эфиопия	T. aethiopicum var. densischimperi	Фиолетовый	5	7
k-624688	Эфиопия	T. aethiopicum var. nigrimarginatum	Фиолетовый	9	9
k-624688	Эфиопия	T. aethiopicum var. schimperi	Фиолетовый	н.д.	н.д
k-624689	Эфиопия	T. aethiopicum var. schimperi	Фиолетовый	9	9
k-624690	Эфиопия	T. aethiopicum var. steudelianum	Фиолетовый	9	9
k-624690	Эфиопия	T. aethiopicum var. pseudoschiperi	Фиолетовый	9	9
k-19553	Эфиопия	T. aethiopicum var. pseudopurpureum	Фиолетовый	н.д.	н.д

Примечание. Для T. boeoticum представлена устойчивость к бурой ржавчине, для T. aethi-opicum — к желтой ржавчине; н.д. — нет данных.

С целью изучения распространения доминантных аллелей генов Pp-1 , которые контролируют фиолетовую окраску вегетативных органов, а совместно с геном Pp3 — фиолетовую окраску зерна, было проведено исследование антоциановой окраски колеоптиля, листового влагалища, ушек и узла соломины у образцов девяти видов пшениц: T. boeoticum ( n = 82), T. mono-coccum ( n = 101), T. urartu ( n = 56), T. dicoccoides ( n = 101), T. dicoccum ( n = 362), T. araraticum ( n = 42), T. persicum ( n = 106), T. polonicum ( n = 50), T. timopheevii ( n = 43) (рис. 2).

Колеоптиль у большинства проанализированных образцов оказалось окрашено. Единственный вид, у которого не было выявлено ни одного образца с окрашенным колеоптилем, — T. persicum . У образцов T. monococcum , T. dicoccum , T. dicoccoides наблюдался полиморфизм окраски колеоптиля, что свидетельствует о наличии аллельного разнообразия генов Pp-1 , включая доминантные и рецессивные аллели. Однако частота встречаемости образцов с антоциановой окраской колеоптиля у T. monococcum , составившая 13 %, была ниже, чем у T. dicoccum и T. dicoccoides , у которых окрашенный колеоптиль имели соответственно 81 и 74 % образцов.

Листовые влагалища были окрашены у всех образцов T. urartu , T. boeoticum , T. dicoccum , T. polonicum , тогда как мы не выявили ни одного образца T. monococcum , T. timopheevii и T. araraticum с антоциановой окраской листовых влагалищ. У T. dicoccoides 96 % образцов имели окрашенные листовые влагалища, у T. persicum — 32 %.

Ушки листового влагалища были окрашены у всех видов, кроме T. monococcum и T. persicum , у которых ни одного образца с антоциановой

окраской ушек выявлено не было, у T. polonicum окраску ушек имели 90 % образцов.

Рис. 2. Частота распространения антоциановой окраски вегетативных органов у редких видов пшеницы из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР). Красным цветом на круговой диаграмме отмечена доля образцов (%), у которых были визуально детектированы антоциановые пигменты в различных частях растений, зеленым цветом — доля образцов, не имеющих антоциановой пигментации; n — число проанализированных образцов.

Узлы соломины были окрашены у всех образцов диплоидных видов пшеницы, за исключением 13 % образцов T. monococcum, тогда как у тетра- плоидных видов окраска узлов соломины была редким признаком: ее обнаружили лишь у образцов T. araraticum и у 23 % образцов T. dicoccoides (см. рис. 2).

Выявленные образцы с антоциановой окраской зерновки были оценены на устойчивость к мучнистой росе и бурой (или стеблевой — в случае T. aethiopicum ) ржавчине. Среди T. boeoticum образцы k-61039, k-61040, k-61660, k-61669 продемонстрировали максимальную устойчивость (9 баллов) к обоим патогенам, также устойчивые к обоим патогенам образцы были выявлены среди T. aethiopicum — k-624688, k-624689, k-624690 (две популяции) (см. табл. 2).

При селекции новых сортов пшеницы с повышенным содержанием антоцианов в зерне, пригодных для производства функциональных продуктов питания, выбор подходящих доноров генов, контролирующих синтез этих соединений, представляет важную задачу. Среди диплоидных видов пшеницы из коллекции ВИР были выявлены образцы T. boeoticum с голубой окраской зерновки. Они служат донорами гена Ba2 . Этот ген был картирован на хромосоме 4A^b (40) и, как установлено позднее, является ортологом гена Ba1 пырея Th. ponticum (33). Помимо T. boeoticum и Th. ponticum , голубая окраска, контролируемая геном Ba2 на хромосоме 4A^m, описана у T. mo-nococcum (41). Однако среди 113 проанализированных образцов T. monococ-cum из коллекции ВИР ни одного образца с голубой окраской зерновки выявлено не было. Возможно, это связано с низкой экспрессивностью признака. J. Dubcovsky с соавт. (41) установили, что T. monococcum содержит аллель гена Ba2 с неполным доминированием, обозначенный авторами как Ba(a) , который определяет слабую голубую окраску зерна, отличную от полной голубой окраски, обусловленной аллелем Ba(b) пырея (41).

С помощью межвидовой гибридизации гены Ba2 T. boeoticum или T. monococcum через тетраплоидную пшеницу могут быть перенесены в геном мягкой пшеницы. При этом у полученных голубозерных линий происходит замещение гомологичных хромосом 4A или 4B пшеницы парой хромосом 4A^b T. boeoticum или 4A^m T. monococcum , как было показано для образцов из коллекции Blaukorn (31), а также пшенично- T boeoticum замещенных линий (42). Поскольку диплоидные виды пшениц несут аллели гена Ba2 , определяющие слабую голубую окраску, то пырей, несущий доминантный аллель гена Ba1 , который контролирует насыщенную голубую окраску, представляется предпочтительным донором. Однако замещение целых хромосом пшеницы хромосомами пырея зачастую приводит к снижению урожайности и ухудшению качества зерна у получаемых голубозерных линий (43-45). Поэтому наиболее предпочтительными донорами для селекции служат образцы с транслокациями фрагментов генома пырея в геном пшеницы. Среди пшенично-пырейных линий с полным замещением хромосом 4B или 4D на хромосомы 4Th пырея, а также линий, дополненных пырейными хромосомами и их плечами, были обнаружены линии, несущие транслокации от пырея в хромосомах 4-й гомеологической группы мягкой пшеницы (45, 46).

На сегодняшний день в селекции на наличие антоцианов в алейроне используются ранее созданные голубозерные линии пшеницы, однако у таких образцов не всегда очевидно происхождение генов Ba (47). Например, в коллекции ВИР нами были выявлены два голубозерных образца T. spelta. Один из образцов (k-28321) под названием Blaukorniger был получен из Германии, где в 1930-е годы Э. Чермак создал коллекцию окрашенных линий пшениц Blaukorn. Большинство голубозерных образцов из этой коллекции было получено на основе пырея (31). Однако позднее цитологический анализ не выявил у ряда образцов геномный материал пырея, в том числе у образца Tschermaks Blaukorniger Sommerweizen (вероятно, идентичного образцу k-28321, зарегистрированному в коллекции ВИР под названием Blaukor-niger), у которого авторы предполагают интрогрессию фрагментов генома от T. monococcum (47).

Второй выявленный образец голубозерной спельты k-45767 получен из Чехословакии, куда были переданы образцы из коллекции Blaukorn, которые активно вовлекались в селекцию голубозерной пшеницы, включая спельту (48). Наличие у выявленных голубозерных образцов T. spelta ПЦР-фрагментов, амплифицированных с помощью молекулярного маркера ThMyc4E-specific, позволяет предполагать, что их голубая окраска может быть обусловлена либо геном Ba1 пырея, либо геном Ba2 T. boeoticum . Дальнейшее выявление нуклеотидных последовательностей генов Ba у доноров признака голубой окраски зерна методами молекулярной генетики и их сравнение с нуклеотидными последовательностями генов Ba у созданных голубозерных линий пшеницы позволит определить происхождение этих генов, в том числе у голубозерных образцов T. spelta из коллекции ВИР.

Тетраплоидных видов пшеницы с голубой окраской в коллекции ВИР мы не выявили, однако были обнаружены образцы T. aethiopicum с фиолетовой окраской зерновки (см. табл. 2). T. aethiopicum — эндемичный вид на территории Эфиопии, Эритреи и Йемена (49). Он рассматривается в качества донора признака фиолетовой окраски зерна, тогда как ни у диплоидных видов, ни у эгилопсов, в том числе доноров геномов мягкой пшеницы (A — T. urartu , B — Aegilops speltoides , D — Ae. tauschii ), фиолетовая окраска зерна не описана (31). Была выделена нуклеотидная последовательность гена Pp3 — TaMyc1p , которая обнаруживалась во всех фиолетовозерных сортах мягкой пшеницы, а также фиолетовозерных образцах тетрапло-идных видов T. durum , T. polonicum , T. turgidum из Эфиопии и Эритреи (25). От T. aethiopicum доминантный аллель гена Pp3 был передан с помощью гибридизации другим тетраплоидам — T. durum и T. dicoccum , T. dicoccon , T. polonicum , T. turgidum , T. carthlicum , а также гексаплоидной пшенице T. aestivum (14, 15, 31, 50, 51). Наличие доминантного аллеля гена Pp3 у всех проанализированных в настоящей работе фиолетовозерных образцов пшеницы было подтверждено с помощью молекулярного маркера Pp3-diagnostic.

Помимо гена Pp3 , для формирования фиолетовой окраски зерновки необходим как минимум один из генов Pp-1 в доминантном состоянии, который также отвечает за окраску вегетативных органов (22). Оценка окраски вегетативных органов — важный этап при селекции фиолетовозерных линий пшеницы (26, 27, 52). Наличие антоциановой пигментации позволяет судить о функциональности ферментов метаболического пути синтеза антоцианов и возможности создать новый генотип с фиолетовой окраской зерна c помощью направленного отбора по одному гену Pp3 , специфически активирующему синтез антоцианов именно в зерне, а не по двум генам Pp3 и Pp-1 , как в случае селекции на основе реципиентного сорта, не имеющего окраски вегетативных органов (16).

Мы провели анализ окраски колеоптиля, листовых влагалищ, ушек листового влагалища и узлов стебля у исследуемых видов пшениц (см. рис. 2). Ранее предполагалось, что антоциановая окраска перечисленных органов контролируется совместно (30). Однако у проанализированных видов пшеницы наблюдались различные паттерны пигментации, что подразумевает наличие специфических генов, контролирующих антоциановую пигментацию в разных органах. Показано, что окраска колеоптиля зачастую проявлялась совместно с окраской ушек листовых пластинок и листовых 966

влагалищ, за исключением T. timopheevii и T. araraticum , у которых при наличии окраски колеоптиля и ушек листовых пластинок отсутствовала окраска листовых влагалищ.

Окраска узлов стебля зачастую не была связана с наличием окраски на других вегетативных органах и, по-видимому, наследовалась независимо. В частности, у некоторых образцов T. dicoccum и T. dicoccoides в лабораторных условиях не наблюдалась антоциановая пигментация колеоптиля, тогда как она была обнаружена на листовых влагалищах и ушках листовых пластинок в полевых условия, где, по-видимому, синтез антоцианов активировался дополнительными стимулами, такими как солнечный свет и другие абиотические факторы.

Влияние среды на интенсивность антоциановой окраски зерна пшеницы отмечено в ряде работ (4, 43, 53). Однако, помимо генов Pp-1 и влияния среды на окраску вегетативных органов, можно предположить наличие регуляторных факторов, специфически контролирующих антоциановую окраску органов у взрослых растений. Так, у T. persicum окраска колеоптиля не наблюдалась, тогда как 34-35 % образцов имели окраску листовых влагалищ. У T. timopheevii и T. araraticum , наоборот, при наличии окраски колеоптиля у всех проанализированных образцов окраска листового влагалища отсутствовала. Рецессивные аллели дополнительных генов, которые приводят к отсутствию окраски колеоптиля либо листовых влагалищ у этих видов, могут объяснить наблюдаемые паттерны пигментации.

Среди T. spelta и T. aethiopicum c антоциановой окраской зерновки были обнаружены образцы, проявляющие устойчивость к грибным заболеваниям в условиях естественного инфекционного фона. Они представляют особый интерес для селекции в качестве доноров, так как несут гены антоциановой окраски зерна в сочетании с генами устойчивости, обеспечивающими генетическую защиту сортообразцов, создаваемых для получения продуктов здорового питания.

Помимо окрашенных образцов, для молекулярно-генетических и эволюционных исследований представляют интерес образцы, не имеющие антоциановой окраски вегетативных органов или проантоцианидинов в зерне. Последние характеризуются белым зерном. У таких образцов можно ожидать присутствия мутации в генах синтеза антоцианов и/или проанто-цианидинов (24, 29). Так, все образцы белозерного вида T. timopheevii имеют окраску колеоптиля, что свидетельствует о функционировании биосинтетического пути синтеза антоцианов. Однако проантоцианидины в зерне у этого вида не образуются. Следовательно, мутации, обусловливающие бе-лозерность, произошли в генах, кодирующих либо специфические для синтеза проантоцианидинов ферменты, либо регуляторные факторы. В дальнейшем необходимо определить, затронули ли мутации гены R-1 , контролирующие синтез проантоцианидинов в зерне у мягкой пшеницы (34), или мутации у этого вида произошли в других генах. Выявленные образцы станут основой для таких исследований. Обратная картина наблюдалась у T. persicum : при отсутствии окраски колеоптиля лишь единичные образцы имели белое зерно, тогда как большинство образцов были краснозерными, что подразумевает наличие мутаций в специфических регуляторных генах синтеза антоцианов, но не проантоцианидинов. Лишь у образцов, характеризующихся отсутствием антоцианов в колеоптиля и проантоцианидинов в зерне (белое зерно), можно ожидать наличия мутаций в ключевых структурных генах или в генах, кодирующих универсальные для двух этих биосинтетических путей регуляторные факторы.

Итак, при анализе признаков антоциановой окраски зерна и вегета- тивных органов у редких видов пшениц из коллекции ВИР были выявлены перспективные доноры для селекции, а также образцы для молекулярногенетических исследований. Показано, что, несмотря на наличие генов с плейотропным эффектом, определяющих окраску различных частей растений, исследуемые виды пшеницы имеют неодинакове паттерны пигментации. У некоторых видов одновременно наблюдалась пигментация всех вегетативных органов либо окраска одних органов и ее отсутствие на других. На основании этого наблюдения сделано предположение, что, помимо известных генов, контролирующих синтез антоцианов в вегетативных органах, существуют не известные до сих пор дополнительные тканеспецифические регуляторные гены, контролирующие синтез антоцианов, и выявленные в коллекции ВИР образцы пшениц служат перспективным материалом для молекулярно-генетических исследований таких генов.