Исследование роли мелатонина в контроле развития т-лимфоцитов, продуцирющих IL-17 (TH17), в период гестации

Эпифизарный гормон мелатонин вовлечен в контроль многих физиологических функций организма, в том число процессов репродукции. В пе риод гестации мелатонин активно синтезируется также яичниками и плацентой [Reiter et aL 2013]. Сывороточная концентрация гормона последовательно нарастает в ходе гестации [Tamura el al., 2008]. Показана значимая роль мелатонина в ус-

(С Глебездина Н. С. Некрасова И. В., Олина А. А., Куклина Е. М.. 2016

пешном развитии беременности. преаде всего, как эффективного антиоксиданта, защищающего от окислительного повреадения плод и плаценту [Tamura ct at, 2008; Lanoix, Guerin. Vaillancourt 2012: Reiter ct at, 2013: Wang ct al.. 2013]. За счет высокой антиоксидантной активности он рассматривается в настоящее время как перспективный препарат для предупреждения ряда осложнений в развитии беременности, в частности, преэклампсии [Hobson et aL 2013]. в то же время, гормон способен эффективно регулировать функции клеток иммунной системы, в первую очередь - CD4⁺ Т-лимфоцитов, продуцирующих IL-17 (Th 17). поскольку' один из двух ключевых факторов дифференцировки Th 17. RORol служит одновременно одним из рецепторов для мелатонина [Куклина, Глебездина. Некрасова, 2015]. Стоит отметить, что Т-клеточная субпопуляция Th 17. несмотря на сравнительно небольшую численность, играет принципиальную роль в защите организма от экс-траклеточных патогенов, напрямую участвует в развитии воспаления, а также в индукции аутоиммунных патологий [Jadidi-Niaragh, Mirshafiey, 2008], Однако при беременности гиперактивация Thl7 может приводить к «срыву» периферической толерантности материнского организма к генетически чужеродному (полу аллогенному) плоду' и. как следствие, к аборту^г [Liu ct at. 2011: Wu ct aL 2014]. Учитывая ключевую роль субпопуляции Th 17 в развитии беременности, ее регуляция мелатонином в этот период представляет особый интерес.

Цель настоящей работы - оценка роли эндогенного мелатонина в регуляции дифференцировки Th 17 при беременности.

Материал и методы исследования

Объектами исследования служили лейкоциты женщин, находящихся в I триместре беременности (средний возраст 28.00 ± 5.29 лет, п = 10), как наиболее критичном в плане индукции спонтанных абортов, а также лейкоциты здоровых неберемен- ных женщин репродуктивного возраста (средний возраст 31.80 ±6.43 лет, п = 10). В работе использовали суспензию мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных центрифугированием в градиенте плотности фиколла-всрографина (1.077 г/см3), и фракционированные методом им-муномагнитной сепарации («R&D Systems», США) CD4^ Т-лимфоциты на фоне стандартной поликлональной активации (aHTH-CD3/CD28, «Invitrogen». США). Вклад эндогенного мелатонина определяли при культивировании лимфоцитов в присутствии аутологичной сыворотки на фоне блокады мелато-нин-зависимых сигналов с использованием лузин-дола («R&D Systems». США) - ингибитора мембранного мелатонинового рецептора (МТ). Уровень CD4+RORyt+ Т-лимфоцитов оценивали как ех vivo, так и после 48 ч. культивирования методом проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител для поверхностного и внутриклеточного окрашивания («Nows Biologicals», США). При этом устанавливали процент CD41 Т-клеток, экспрессирующих RORyt и уровень экспрессии на клетках данного транскрипционного фактора, определяемый как средняя интенсивность свечения (Middle Fluorescence Intensity, MFI; условные единицы). Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические конгроли. Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 48 ч. культивирования. составляла 95-98%. Статистический анализ проводили с использованием парного и непарного t-критерия Стьюдента, непараметрических критериев Вилкоксона и Манн-Уитни.

Результаты и их обсуждение

Показано, что уровень CD4+RORyi' Т-клеток. оцениваемый ex уАю, не отличался в группах беременных I триместра и небеременных женщин. При этом обнаружены достоверные отличия между группами по MFI (таблица).

Изменение процентного содержания и MFI ТЫ 7-лимфоцитов в условиях активации и ингибирования

Примечание. а-р<0.05по сравнению с небеременными; Ь-р<0.05по сравнению с ex vivo; с - р < 0.05 по сравнению с 48-часовой активацией.

По результатам 48-часовой активации в присутствии аутологичной сыворотки установлено повышение процента CD4+RORyt' Т-клеток как у небеременных женщин, так и в группе ременных женщин, так и в группе беременных При этом уровень экспрессии RORyt в CD4' Т-лимфоцитах в группе небеременных также возрас- тал, а в группе беременных наоборот снижался (таблица).

На фоне блокады мелатонин-зависимых сигналов процент CD4+RORyt⁺ Т-клеток снижался практически до уровня, сравнимого с исходным (ег vivo). Степень экспрессии RORyt в CD4^ Т-лимфоцитах беременных женщин при внесении ингибитора наоборот возрастала. В то же время в группе небеременных интенсивность свечения RORyt осталась практически неизменной (таблица).

Таким образом, хотя процент Th 17 клеток у женщин, находящихся в I триместре беременности, и небеременных женщин не отличался как ег vivo, так и после 48-часовой активации при исследовании такого показателя, как MFI RORyt, выявлены интересные различия. Так, при активации Т-лимфоцитов в группе небеременных MFI растет параллельно с увеличением процента CD4+RORyt⁺ клеток, а в группе беременных снижается.

Несмотря на то, что действие мелатонина через поверхностный рецептор МТ при исследовании процента CD4+RORyt+ лимфоцитов выявлено в обеих исследуемых группах, участие данного гормона в регуляции MFT установлено лишь в группе беременных, т.к. под действием лузиндола степень экспрессии RORyt в группе небеременных не менялась. Вероятно, это может быть связано с вовлечением внутриклеточного рецептора для гормона - RORct.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-34-60094 мол а дк.