Исследование способности аполипопротеина А-I в комплексе с актиномицином Д оказывать кардиотоксическое действие на изолированное сердце крысы

На сегодняшний день зарегистрировано большое количество препаратов, обладающих противоопухолевой активностью. Эффективность их применения доказана клинически. Главная проблема при их использовании в терапии рака — низкая избирательность действия и высокая системная токсичность. Разработка новых транспортных систем

Статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

Patologiya krovoobrashcheniya i kardiokhirurgiya . 2016;20(4):88-95

доставки лекарственных препаратов имеет принципиальное значение для повышения эффективности химиотерапии [1].

Потенциальными переносчиками противоопухолевых препаратов могут выступать липопротеины низкой плотности, липопротеины высокой плотности (ЛПВП), а также их главный белковый компонент — аполипопротеин А-I (апоА-I) [2]. Специалисты Научно-исследовательского института биохимии (Новосибирск, Россия) обнаружили принципиальную возможность апоА-I образовывать устойчивые комплексы и проникать в цитоплазму и ядра клеток асцитной карциномы Эрлиха с такими противоопухолевыми препаратами, как винбластин и актиномицин Д [3]. На культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха показано, что при использовании апоА-I с актиномицином Д в концентрации цитостатика 0,1 мкг/мл инкубационной среды снижается пролиферация опухолевых клеток, в то время как препарат без переносчика в этой же концентрации противоопухолевой активностью не обладает. Кроме того, на культуре гепатоцитов крыс показано, что апоА-I с актиномицином Д не оказывают цитостатического эффекта на нормальные (здоровые) клетки [4].

Среди побочных эффектов противоопухолевых препаратов следует выделить кардиотоксичность, которая может выражаться бессимптомными изменениями на электрокардиографии, инфарктом миокарда, вплоть до токсической кардиомиопатии с явлениями тяжелой сердечной недостаточности [5]. Разработка новых противоопухолевых препаратов напрямую связана с оценкой их влияния на сердечно-сосудистую систему. Следует отметить, что данные о влиянии актиномицина Д на работу миокарда противоречивы, а также трудно сопоставимы из-за немногочисленности.

Цель исследования: изучить способность аполипопротеина A-I с противоопухолевым препаратом актиномицином Д вызывать функциональные нарушения в работе изолированного сердца крысы в сравнении с чистым актиномицином Д.

Методы

Эксперименты на лабораторных животных проводили в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 №755 и приложение к приказу № 565 от 04.10.1977), принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации. Животные содержались на стандартной диете и имели свободный доступ к воде. Работа одобрена комитетом по биоэтике НИИ биохимии.

Провели эксперименты на крысах-самцах Вистар массой 200–300 г. За 1 ч до опыта животным внутрибрюшинно вво- дили гепарин (500 ед. на крысу). После декапитации сердце быстро извлекали и помещали в стаканчик с охлажденным перфузионным раствором. В аорту вводили канюлю, которую подсоединяли к перфузионной системе. Перфузию проводили через коронарные сосуды под постоянным давлением 60 мм ртутного столба. В качестве перфузата использовали модифицированный буфер Кребса – Хензеляйта, содержащий NaCl — 118 mM, KCl — 4,7 mM, CaCl2 — 3 mM, MgSO4 — 1,2 mM, KH2PO4 — 1,2 mM, NaHCO3 — 25 mM, ЭД-ТА-Na2 — 0,5 mM, глюкозу — 5 mM при насыщении карбогеном (95% O2 и 5% CO2) и постоянном контроле рН (7,4); температура раствора — 37,5 °С. Для регистрации давления в левом желудочке в левом предсердии за ушком делали разрез, через него вводили с перфузионным раствором латексный баллончик, соединенный с цифровым датчиком. Баллончик вводили сначала в полость предсердия, затем через митральный клапан в полость левого желудочка. Объемную скорость коронарного потока определяли по объему оттекающей от сердца жидкости (мл/мин). Содержание кислорода устанавливали полярографическим методом с использованием электрода Кларка. Регистрировали частоту и скорость сокращения. Работоспособность (Р) определяли как произведение прироста давления на частоту сокращений в минуту. Показателем эффективности работы было отношение выполненной работы (работоспособности) к величине коронарного потока (Р/КП). В качестве показателя энергетической нагрузки на миокард определяли отношение произведения (АО2 х КП) на единицу выполненной работы [6].

Перфузию сердца проводили в режиме рециркуляции перфузионного раствора, что позволяло значительно уменьшать количество перфузата по сравнению с незамкнутой системой. Объем перфузируемой жидкости в системе не превышал 30 мл.

Каждое выделенное сердце работало не менее 15 мин без рециркуляции перфузионного раствора до установления постоянных показателей амплитуды и частоты сокращений. Затем в перфузионный раствор вносили исследуемый компонент, и сердце работало в режиме рециркуляции в течение 30 мин.

Исходные (фоновые) показатели работы сердца крысы различались между собой, поэтому изменения в работе миокарда под влиянием изучаемых компонентов оценивали в процентах по отношению к исходным показателям.

Аполипопротеин А-I выделяли из фракции ЛПВП. Де-липидирование проводили охлажденной смесью хлороформа и метанола (1 : 1): 20 мл смеси на 1 мл ЛПВП с последующей многократной отмывкой эфиром. Для получения апоА-I суммарные белки ЛПВП в растворе

3% Ds-Na и 0,1% меркаптоэтанола наносили на колонку (1,6 х 100 см) с Сефарозой 6B-CL (Pharmacia, Швеция) и элюировали 5 мМ Трис-НСl буфером, рН 8,6, содержащим 6 М мочевины, 0,01% азида натрия и 1 мМ фенилметансуль-фонилфторида. Проверка чистоты апоА-I осуществлялась с помощью электрофореза в 10% ПААГ с Ds-Na. Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% уксусной кислоты (1 : 1) [7].

Обессоливание апоА-I проводили методом гель-фильтрации (колонка: 40 х 0,8 см, Сефадекс G-25 (Pharmacia, Швеция), элюент: 5 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl). Профиль элюции регистрировали на детекторе ультрафиолета при длине волны 280 нм. Концентрация обессоленного белка составляла 0,2 мг/мл. Полученный белок стерилизовали фильтрами BIOFIL 45 µм и использовали в течение 3–5 дней. В работе использовали 1 мМ маточный раствор актиномицина Д (Applichem, Германия).

Комплекс аполипопротеина А-I с актиномицином Д получали, выдерживая их смесь в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4 в течение 15 мин при комнатной температуре. Актиномицин Д в перфузате исследовали в двух концентрациях — 1 и 0,1 мкг/мл. Образование комплексов апоА-I с актиномицином Д подтверждали методом тушения триптофановой флуоресценции [3].

Дизайн исследования

Проводили эксперименты в трех группах: 1-я — актиномицин Д в концентрации 1 мкг/мл перфузата; 2-я — ак- тиномицин Д в концентрации 0,1 мкг/мл перфузата; 3-я — аполипопротеин А-I c актиномицином Д в концентрации 0,1 мкг/1 мл перфузата. В каждой группе было пять особей. Каждое выделенное сердце работало не менее 15 мин без рециркуляции перфузионного раствора до установления постоянных показателей амплитуды и частоты сокращений. После этого измеряли исходные (КП, Р, Р/КП) и (АО2 и (АО2 х КП)/Р) контрольные показатели. Затем в перфузионный раствор вносили исследуемый компонент, и сердце работало в режиме рециркуляции в течение 30 мин. В работе представлены данные, полученные на 20-й мин перфузии в присутствии исследуемых компонентов, поскольку в это время установили максимальные показатели работоспособности (КП, Р, Р/КП) и энергетической нагрузки на миокард (АО2 и (АО2х КП)/Р).

Исходные (фоновые) показатели работы сердца крысы различались между собой, поэтому изменения в работе миокарда под влиянием изучаемых компонентов оценивали в процентах по отношению к исходным контрольным показателям.

Статистический анализ

Данные подвергали статистическому анализу с использованием программы StatPlus 2009 Professional 5.8.4 (США). Статистическую значимость результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для связанных выборок (до и после введения исследуемого компонента) при p<0,05.

Рис. 1. Запись работы изолированного сердца крысы: A — в контроле (исходное состояние); B — при добавлении в перфузат 1 мкг/мл актиномицина Д. Время перфузии 20 мин

Fig. 1. Isolated rat heart performance: ( A ) the control (baseline); ( B ) when adding 1 µg/ml of actinomycin D into perfusate. Perfusion time 20 min

Контроль / Control Актиномицин Д /

Actinomycin D

КП

ЧСС Давление   ΔО в ЛЖ        2

_P/КП     О ₂ /ед. вып.

работы

Рис. 2. Показатели работоспособности и энергетической нагрузки изолированного сердца в присутствии актиномицина Д в концентрации 1 мкг/мл (M±m)

Примечание. КП — коронарный поток, ЧСС — частота сердечных сокращений, ЛЖ — левый желудочек, Р — работоспособность сердца, * — p<0,05 по отношению к контролю

Fig. 2. Isolated heart efficiency and energy load, with actinomycin D administered in concentration of 1 µg/ml (M+m). КП — coronary flow; ЧСС — heart rate; ЛЖ — left ventricle; P — heart efficiency; * — p<0.05 against the control

Результаты

В перфузионном растворе актиномицин Д в концентрации 1 мкг/мл приводил к снижению систолического давления в левом желудочке на 22% (рис. 1). При этом отмечено увеличение давления в левом желудочке в фазу диастолы на 50% относительно исходных показателей, что говорит об уменьшении способности миокарда к расслаблению.

Как следует из рис. 2, актиномицин Д снижал частоту сердечных сокращений на 13% и работоспособность сердца на 26%. Коронарный поток в свою очередь оставался на контрольных значениях, что уменьшало эффективность выполненной работы (Р/КП) на 25%. В присутствии актиномицина Д повышалось поглощение кислорода на 8%, при этом показатель потребления кислорода на единицу выполненной работы увеличивался на 44%, что свидетельствует о существенном росте энергетической нагрузки на ткань миокарда (рис. 2).

Десятикратное снижение концентрации актиномицина Д в перфузате до 0,1 мкг/мл приводило практически к исходным показателям гемодинамики. Можно отметить даже снижение давления в левом желудочке в фазу диастолы на 16% относительно исходных показателей, что говорит об увеличении способности миокарда к расслаблению.

Из данных на рис. 3 следует, что происходило достоверное снижение коронарного потока на 9% и увеличение эффективности работы сердца на 16% (Р/КП). Другие показатели не имели достоверных отличий по отношению к исходным величинам.

Присутствие в перфузате актиномицина Д в концентрации 0,1 мкг/мл с апоА-I (рис. 5) приводило к росту давления в левом желудочке в фазу систолы на 10%, а также частоты сердечных сокращений на 15% относительно исходных значений, что говорит об увеличении сократительной способности миокарда. При этом способность сердечной мышцы к расслаблению снижалась на 16% относительно исходных показателей (рис. 4).

Присутствие в перфузате актиномицина Д в концентрации 0,1 мкг/мл с апоА-I повышало работоспособность сердца на 26%, однако увеличение коронарного потока на 30% приводило работоспособность на уровень контроля (рис. 5). Потребление кислорода снижалось на 11%, в то время как потребление кислорода на единицу работы уменьшилось на 8%, что указывает на снижение общей энергетической нагрузки на миокард.

Обсуждение

Актиномицин Д (дактиномицин) — цитостатический препарат из группы противоопухолевых антибиотиков, подгруппы актиномицинов, продуцируемый.

Противоопухолевое действие связано с тем, что он ин-теркалирует между парами азотистых оснований гуанин —

% 140

Контроль / Control Актиномицин Д /

Actinomycin D

КП

P

ЧСС Давление   ΔО в ЛЖ2

_{P / КП} О /ед. вып. работы

Рис. 3. Показатели работоспособности и энергетической нагрузки изолированного сердца в присутствии актиномицина Д в концентрации 0,1 мкг/мл (M±m)

Примечание . КП — коронарный поток, ЧСС — частота сердечных сокращений, ЛЖ — левый желудочек, Р — работоспособность сердца, * — p<0,05 по отношению к контролю

Fig. 3. Indicators of isolated heart efficiency and energy load, when adding 0.1 µg/ml of actinomycin D (M+m)

КП — coronary flow, ЧСС — heart rate, ЛЖ — left ventricle, P — heart efficiency * — p<0.05 against the control цитозин дезоксирибонуклеиновой кислоты и препятствует движению полимеразы рибонуклеиновой кислоты, нарушая таким образом транскрипцию антиапоптозных генов [8]. В основном актиномицин Д используют в качестве средства для лечения различных опухолей у детей, в том числе опухоли Вильмса, рабдомиосаркомы и саркомы Юинга [9]. История препарата насчитывает уже более 70 лет, исследо- ваны механизм, дозировки, различные побочные эффекты, среди которых, как правило, гепатотоксичность, гематологические и дерматологические нарушения [10]. Показано, что актиномицин Д без существенных побочных проявлений в комбинации с кортикостероидами позволял практически вдвое снижать курсовую дозу последних у больных с пересаженным сердцем [11]. Однако исследования на изо-

Рис. 4. Запись работы изолированного сердца крысы: A — в контроле (исходное состояние); B — при добавлении в перфузат апоА-I и актиномицина Д. Концентрация цитостатика в комплексе 0,1 мкг/мл. Время перфузии 20 мин

Fig. 4. Isolated rat heart performance: A — the control (baseline); B — when adding apoA-1 and actinomycin D. Cytostatic concentration is 0.1 µg/ml. Perfusion time 20 min

Время перфузии 20 мин / Perfusion time 20 min

Контроль / Control ■ Актиномицин Д /

Actinomycin D

КП ЧСС Давление ΔО    P в ЛЖ      2

_{P / КП} О ₂ /ед. вып. работы

Рис. 5. Показатели работоспособности и энергетической нагрузки изолированного сердца в присутствии апоА-I и актиномицина Д. Концентрация цитостатика в комплексе 0,1 мкг/мл (M±m)

Примечание. КП — коронарный поток; ЧСС — частота сердечных сокращений; ЛЖ — левый желудочек; Р — работоспособность сердца; * — p<0,05 по отношению к контролю

Fig. 5. Indicators of isolated rat heart performance and energy load when adding apoA-1 and actinomycin D. Cytostatic concentration in the complex is 0.1 µg/ml (M+m). КП — coronary flow; ЧСС — heart rate; ЛЖ — left ventricle; P — heart efficiency; * p <0.05 against the control лированном сокращающемся сердце крысы показали, что актиномицин Д устраняет кардиопротекторное действие дексаметазона при ишемии/реперфузии [12]. Таким образом, данные о влиянии дактиномицина на работу миокарда противоречивы, а также трудно сопоставимы из-за их немногочисленности. Тем не менее в литературе отсутствуют данные о кардиотоксических свойствах препарата [6], поэтому на первом этапе мы изучили влияние актиномицина Д на функциональные показатели гемодинамики и энергетический статус миокарда. Мы использовали концентрации, при которых актиномицин Д ингибировал пролиферацию клеток остеосаркомы человека MG63 [13]. В концентрации 1 мкг/мл актиномицин Д оказывал выраженное кардиоток-сическое действие, снижал показатели работоспособности сердца при одновременном увеличении энергетической нагрузки на миокард. При этой концентрации (1 мкг/мл актиномицина Д) показатели достигали максимальных негативных значений уже на 20 мин перфузии. Вопрос о механизме такого эффекта остается открытым и требует дальнейших исследований. Однако полученные данные указывают на необходимость оценки особенностей и функционального состояния сердечно-сосудистой системы при назначении актиномицина Д как противоопухолевого препарата.

Использование актиномицина Д в концентрации 0,1 мкг/мл не приводит к нарушениям в работе сердца, что предсказуемо, поскольку при такой концентрации актиномицин Д оказывал слабый противоопухолевый эффект [13].

Следует отметить, что ранее мы получили данные об эффективности апоА-I с актиномицином Д в концентрации 0,1 мкг/мл в отношении культуры клеток асцитной карциномы Эрлиха [4]. Логично было предположить, что комплекс также способен вызывать нарушения в работе миокарда, однако апоА-I с актиномицином Д показал неожиданный результат. Комплекс усиливает функциональные показатели работоспособности сердца при снижении потребления кислорода на единицу выполненной работы. Такой эффект можно объяснить использованием в качестве переносчика апоА-I. Действительно, на изолированном сердце крысы показано, что апоА-I в физиологической концентрации вызывал стабильное увеличение давления внутри левого желудочка, повышал скорость сокращения и расслабления мускулатуры при незначительном изменении частоты сердечных сокращений [7]. Отличие эффекта апоА-I с актиномицином Д от воздействия апоА-I без цитостатика заключается в увеличении скорости коронарного потока, что также может благоприятно влиять на показатели гемодинамики пациентов, получающих химиотерапию.

Заключение

В условиях эксперимента на модели изолированного сердца крысы показано, что аполипопротеин А-I с актиномицином Д в концентрации 0,1 мг/мл не вызывают кардиотоксического действия, а, напротив, способствуют улучшению функциональных показателей работоспособности миокарда за счет белкового компонента в качестве переносчика цитостатика. Учитывая способность комплекса обладать кардиотоническим действием на фоне вазодилатации, можно рекомендовать его для исследований эффективности противоопухолевого действия при моделировании функциональных нарушений сердечно-сосудистой системы.

Финансирование

Работа поддержана бюджетным проектом федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» по теме НИР – 085.