Исследование сухих экстрактов клевера и цикория с оценкой их влияния на фенотип спленоцитов мышей при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии

Современная биомедицина уделяет особое внимание изучению механизмов регуляции иммунной системы и поиску средств, способных поддерживать ее функциональную активность, нарушаемую как при хронических заболеваниях, так и в результате воздействия фармакологических агентов с цитостатическим эффектом. Метотрексат (МТХ), широко применяемый в терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний, несмотря на высокую клиническую эффективность, вызывает выраженное угнетение иммунного ответа [Cronstein, 2005]. Иммуносупрессивное действие МТХ проявляется снижением пролиферативной активности лимфоцитов, нарушением дифференцировки Т- и В-клеток, уменьшением числа зрелых В-клеток в селезенке и лимфоидных органах, а также нарушением продукции антител, что делает необходимым поиск средств, способных компенсировать эти неблагоприятные эффекты и поддерживать гомеостаз иммунной системы [Железнова, 2010]. Иммунный статус организма определяется функциональной интеграцией Т- и В-лимфоцитарных популяций, экспрессия специфических мембранных маркеров которых позволяет количественно и качественно оценивать состояние иммунной системы. Маркеры Т-клеточного звена CD3+, CD4+ и CD8+ отражают общий пул Т-лимфоцитов, субпопуляции Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток соответственно, участвуя в регуляции клеточного иммунного ответа и координации взаимодействия с другими компонентами иммунной системы. Мембранный белок CD20+, локализованный на зрелых В-лимфоцитах, играет ключевую роль в регуляции их активации, пролиферации и дифференцировки, а также обеспечивает эффективность формирования антительного ответа в В-кле-точных зонах селезенки и лимфоузлов [Menees et al., 2021]. Изучение факторов, способных модулировать экспрессию CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+, является важной задачей как фундаментальной, так и прикладной иммунофармакологии. Среди исследуемых подходов особое внимание уделяется биологически активным веществам (БАВ) растительного происхождения. В частности, фенольные соединения, обладающие антиоксидантной (АОА) и противовоспалительной активностью, могут оказывать влияние на популяционный состав лимфоцитов и стимулировать продукцию антител [Middleton et al., 2000]. Также было показано, что на фоне иммуносупрессии сухие экстракты цикория и клевера способствовали восстановлению параметров врожденного (фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов) и адаптивного иммунитета (реакции антителообразования, гемагглютинации и гиперчувствительности замедленного типа), активации антиоксидантных ферментов и снижению уровня продуктов перекисного окисления липидов [Сайбель и др., 2020, Синеговец др., 2025].

Цель исследования – определение количественного содержания фенольных соединений, антиоксидантной активности, острой токсичности сухих экстрактов клевера и цикория с оценкой их влияния на фенотип спленоцитов при иммуносупрессии, вызванной метотрексатом.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования являлись сухие экстракты травы клевера лугового (СЭКТ) [Патент РФ №2803502] и травы цикория обыкновенного (СЭЦТ) [Патент РФ №2828665], полученные методом перколяции с использованием этилового спирта.

Определение количественного содержания фенольных соединений в СЭКТ в пересчете на рутин и в СЭЦТ в пересчете на цикориевую кислоту осуществляли методом дифференциальной УФ-спектрофотометрии на спектрофотометре УФ-1200 («Shanghai Mapada Instruments Co., Ltd», Китай) [ГФ РФ XV]. Об АОА экстрактов судили по способности ингибировать аутоокисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода. Измерение проводили на спектрофотометре УФ-1200 («Shanghai Mapada Instruments Co., Ltd», Китай) по отношению к раствору адреналина гидрохлорида с расчетом АОА в процентах. Величина более 10% свидетельствует о наличии АОА [Рябинина и др., 2011].

Определение острой пероральной токсичности проводили на 15 крысах-самках линии Wistar массой 180–220 г [ГОСТ 32644-2014; OECD Test No. 423:2001]. Животные получали перорально через желудочный зонд однократно водные растворы сухих экстрактов из расчета 5, 50, 300, 2000 мг/кг. При изучении острой пероральной токсичности клиническое наблюдение за каждым животным проводили после введения препарата ежедневно в течение последующих 14 дней. Фиксировали и отражали в первичной документации массу и выживаемость животных [ГОСТ 32644-2014; OECD Test No. 423:2001; Бибик и др., 2019].

Оценку влияние сухих экстрактов на иммунологические показатели проводили на беспородных мышах-самцах массой 18–22 г. Экспериментальная апробация и протокол исследования одобрен Локальным Этическим Комитетом ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России (протокол № 342 от 20.09.2024). Иммуносупрессию вызывали препаратом «Метотрексат» («Эбеве-Фарма», Австрия, лекарственная форма – раствор для внутривенного и внутримышечного введения во флаконах) путем однократного внутрибрюшинного введения в дозе 10 мг/кг [Железнова, 2010]. Полученные сухие экстракты вводили животным в виде водного раствора. По результатам экспериментальных исследований зависимости «доза – эффект» с использованием доз от 50 до 400 мг/кг была установлена экспериментально-терапевтическая доза 50 мг/кг путем перорального введения 1 раз в сутки на протяжении 3 дней [Михайлова и др., 2023, 2024]. Для сравнения был выбран препарат «Иммунал» (на основе экстракта эхинацеи пурпурной, «Sandoz», Словения), который вводили животным перорально 1 раз в сутки в виде водного раствора в дозе 240 мг/кг в течение 3 дней. Выбор референтного препарата обоснован его клинически подтверждённой эффективностью, широким применением в медицинской практике и особенностями фармакологического действия, реализующегося за счет содержания фенольных соединений, как и в исследуемых экстрактах [Морозов, 2009, Сайбель и др., 2020]. В интактную группу были включены мыши того же возраста, массы и пола, которые получали воду очищенную в соответствующем объеме по аналогичной схеме. Экспериментальные животные были разделены в соответствии с получаемыми веществами на следующие группы: 1-интактная (ИНТ), 2-иммунал 240 мг/кг (ИММ), 3- СЭЦТ 50 мг/кг, 4- СЭКТ 50 мг/кг, 5-МТХ 10 мг/кг, 6-МТХ 10 мг/кг+ ИММ 240 мг/кг, 7-МТХ 10 мг/кг +СЭЦТ 50 мг/кг, 8-МТХ 10 мг/кг +СЭКТ 50 мг/кг.

Массу животных и селезенки определяли на лабораторных весах («Масса-К» ВК-3000, Россия), после гомогенизации селезенки в камере Горяева определяли общее количество спленоцитов в органе. Селезеночный индекс рассчитывали как отношение массы селезенки (мг) к массе животного (г), также определяли отношения количества спленоцитов к массе животного и числа спленоцитов к массе селезенки [Волчегорский и др., 2000].

Для определения влияния на иммунофенотипирование спленоцитов выделенные селезенки фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч. После проведения стандартной проводки и заливки в парафин были изготовлены срезы на ротационном микротоме «Leica» RM2125 RTS («Leica Biosystems Melboume Pty Ltd», Австралия). Для оценки иммунного статуса животных были применены моноклональные антитела к антигенным маркерам CD3 (клон G4,18, «Elabscience» Китай), CD4 (клон OX-38, «Elabscience» Китай), CD8 (клон OX-8, «Elabscience» Китай) и поликлональное CD20 («Elabscience» Китай) в разведении 1:500. Процедура окрашивания проводилась согласно протоколу производителя с помощью системы окрашивания «BOND-MAX» («Leica Biosystems Melboume Pty Ltd», Австралия). Система визуализации включала DAB с гематоксилином. Для отрицательного контроля первичные антитела были заменены фосфатно-солевым буфером. Окрашенные гистологические срезы оцифровывали с помощью цельнопредметного сканера слайдов «Aperio CS2» («Leica Biosystems Melboume Pty Ltd», Австралия) с использованием объектива 20 х . Количественный анализ оцифрованных изображений проводили с использованием программного обеспечения для цифровой патологии QuPath (версия 0.3.2). Вручную размечали регионы интереса для последовательного анализа: периартериолярные лимфоидные муфты (ПАЛМ), В-клеточные фолликулы. Для каждого маркера запускали встроенный алгоритм «Positive Cell Detection». Параметры детекции калибровали вручную для каждого антитела с учетом специфики окрашивания (ядерное, цитоплазматическое, мембранное). Результаты автоматической детекции в обязательном порядке верифицировали визуально. Были экспортированы следующие количественные параметры: площадь фолликулов, площадь ПАЛМ, плотность положительных клеток (на мм²) для каждого маркера.

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ XV издания ОФС.1.1.0013 «Статистическая обработка результатов физических, физико-химических и химических испытаний». Нормальность распределения признака определяли с помощью W-теста Шапиро – Уилка. При нормальном распределении для оценки различий показателей использовали критерий Стьюдента, для ненормально распределенных параметров использовали тест Манна – Уитни с расчетом медианы и квартилей (Me [Q 1 ; Q 3 ]). Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в исследовании принимался равным 0.05.

Результаты и их обсуждение

Исследование количественного содержания фенольных соединений и выраженности АОА изучаемых сухих экстрактов показало, что уровень фенольных соединений в сухом экстракте клевера лугового в пересчете на рутин составил 6.50±0.01%, выраженность АОА ‒ 47.64±2.15%, в сухом экстракте цикория обыкновенного накопление фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту составила 8.24±0.01%, а выраженность АОА – 62.67±1.85%, что свидетельствует о значительном проявлении антиоксидантных свойств исследуемых экстрактов [Рябинина и др., 2011].

О токсическом действии экстрактов судили по изменению массы животных и их выживаемости. За 14-дневный период наблюдения после перорального введения сухих экстрактов травы клевера лугового и травы цикория обыкновенного не было зафиксировано ни одного случая гибели мышей ни на одной из указанных дозировок, а также не отмечено статистически значимого изменения массы тела, в связи с чем полученные результаты позволяют констатировать, что сухие экстракты цикория обыкновенного и клевера лугового относятся к малотоксичным веществам, что соответствует 5 классу токсичности (LD50≥5000 мг/кг) [ГОСТ 32644-2014; OECD Test No. 423:2001], и могут применяться в дальнейших исследованиях.

Анализ полученных результатов влияния исследуемых сухих экстрактов на показатели массы мышей и количество спленоцитов установил, что по сравнению с интактной группой мышей сухие экстракты клевера и цикория, а также «Иммунал» в подавляющем большинстве результатов не изменяли массу мышей и селезенки, число спленоцитов, а также селезеночный индекс и отношение количества сплено-цитов к массе животного и массе селезенки (табл. 1).

Таблица 1

Влияние сухих экстрактов на показатели массы мышей и количество спленоцитов при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии (Me [Q1; Q3])

[Effect of dry extracts on mouse weight and splenocyte count in methotrexate-induced immunosuppression]

Группа	Масса мыши, г	Масса селезенки, мг	Число спле-ноцитов, х106/орган	Селезеночный индекс, мг/г	Число спленоцитов/ масса тела, х106/г	Число спленоцитов/ масса селезенки, х106/мг
ИНТ	26	135	155	4.75	5.77	1.12
n=8	[26; 28]	[124; 141]	[150; 159]	[4.49; 5.21]	[5.17; 6.08]	[1.09; 1.17]
ИММ	28	132	145	4.62	5.13	1.11
n=8	[27; 30]	[123; 138]	[131; 154]	[4.35; 5.09]	[4.82; 5.43]	[1.08; 1.13]
СЭЦТ	28	130	163#	4.64	5.76#	1.27#
n=8	[28; 29]	[122; 134]	[154; 172]	[4.32; 4.84]	[5.50; 6.19]	[1.19; 1.40]
СЭКТ	25	137	146	5.53	5.91	1.14
n=8	[23; 34]	[135; 138]	[142; 151]	[4.08; 5.82]	[4.25; 6.31]	[1.12; 1.16]
МТХ	24*#	111*#	112*#	4.53	4.71*	1.03*#
n=8	[23; 24]	[98; 112]	[107; 114]	[4.35; 4.64]	[4.58; 4.84	[1.02; 1.06]
МТХ+ ИММ n=8	27▲	128▲	150▲	4.83	5.74▲	1.19▲
	[26; 27]	[125; 131]	[145; 156]	[4.38; 5.28]	[5.42; 6.43]	[1.15; 1.23]
МТХ+ СЭЦТ n=8	29▲	135▲	143▲	4.68	5.02	1.04
	[26; 31]	[125; 138]	[140; 156]	[4.42; 4.90]	[4.75; 5.48]	[1.03; 1.25]
МТХ+ СЭКТ n=8	27▲	130▲	151▲	4.61	5.71▲	1.23▲
	[26; 28]	[119; 140]	[144; 171]	[4.25; 5.18]	[5.09; 6.73]	[1.16; 1.35]

Примечание: здесь и далее различия параметров статистически значимы при р ≤ 0.05: * – по сравнению с животными 1 группы; # – по сравнению с животными 2 группы; ▲ – по сравнению с животными 5 группы.

Результаты, полученные при введении животным МТХ, напротив, указывали на статистически значимое снижение массы мышей и селезенки, числа спленоцитов, совместно с отношением количества спленоцитов к массе животного и массе селезенки. В случае введения сухих экстрактов клевера, цикория, а также препарата сравнения на фоне влияния цитостатика, отмечалось статистически значимое изменение параметров, заключающееся в восстановлении до уровня интактных животных: массы мышей и массы селезенки, числа спленоцитов, отношения количества спленоцитов к массе животного и массе селезенки, что говорит о наличии иммунотропных свойств, изучаемых фитосубстанций (табл. 1).

Исследование фенотипа спленоцитов установило, что в интактной группе животных показатели морфофункционального состояния селезенки соответствовали норме [Кузнецов и др., 2002]. Т-клеточная зона (ПАЛМ) имела сохраненную архитектонику и достаточную плотность CD3 + лимфоцитов. Также отмечалось сбалансированное распределение субпопуляций CD4+ и CD8+ клеток. В-клеточные зоны характеризовались хорошо выраженными фолликулами с четкой структурной организацией и высокой кле-точностью (табл. 2). Эти данные послужили ориентиром для последующего анализа изменений под воздействием исследуемых препаратов.

Таблица 2

Влияние сухих экстрактов на фенотип спленоцитов мышей при метотрексат-индуцированной иммуносупрессии (Me [Q1; Q3])

[Effect of dry extracts on the phenotype of mouse splenocytes in methotrexate-induced immunosuppression]

Группа	CD3+, ед./1мм2	CD4+, ед./1мм2	CD8+, ед./1мм2	Площадь ПАЛМ, мкм2	CD20+, ед./1мм2	Площадь фолликула, мкм2
ИНТ n=8	4482 [4194; 4789]	3834 [3300; 4942]	3782 [3519; 4478]	128930 [97921; 135552]	160300 [15613; 16474]	80835 [75948; 83855]
ИММ n=8	4077 [3905; 4381]	3777 [3345; 4386]	4000 [3820; 4496]	100260 [92438; 101663]	16400 [15949; 16791]	71550 [67187; 82862]
СЭЦТ n=8	4355 [4025; 4682]	4029 [3901; 4428]	3512 [3265; 4049]	74067 [73332; 81404]	15959 [15508; 16373]	79756 [72012; 87526]
СЭКТ n=8	4589 [4435; 4697]	4162 [3954; 4397]	3329# [3107; 3478]	85044# [78117; 91852]	15732 [15396; 15828]	82655 [77359; 89324]
МТХ n=8	3218*# [2456; 3375]	2832*# [2548; 3291]	1962*# [1926; 2117]	50051# [45040; 54296]	13675*# [13408; 14009]	71901* [69385; 73847]
МТХ+ ИММ n=8	4403▲ [4312; 4558]	3806▲ [3572; 4050]	3833▲ [3714; 3900]	79199▲ [59526; 84101]	15346▲ [15254; 15668]	75017 [72215; 76698]
МТХ+ СЭЦТ n=8	4155▲ [3924; 4417]	3772▲ [3532; 3952]	3446▲# [3066; 3773]	66944▲ [65140; 69588]	15584▲ [15169; 15979]	75381 [74521; 76703]
МТХ+ СЭКТ n=8	4400▲ [4238; 4730]	4048▲ [3848; 4188]	3221▲# [3101; 3651]	75016▲ [72824; 76607]	15351▲ [15313; 15646]	74687 [73790; 76664]

В группах животных, получавших ИММ, СЭЦТ и СЭКТ показатели, характеризующие Т-зону (экспрессия CD3+, а также распределение субпопуляций CD4+ и CD8+ клеток), находились в пределах значений интактной группы, что указывает на отсутствие иммуносупрессивного эффекта данных экстрактов (рис. 1–3). Экспрессия CD20+ в В-клеточной зоне сохранялась на уровне интактной группы, площадь В-фолликулов также не демонстрировала выраженных отклонений, подтверждая стабильность структурной организации селезенки (рис. 4). На рисунках 1–4 цифрами обозначены: 1 ‒ центральная артериола, 2 ‒ белая пульпа, 3 ‒ красная пульпа, 4 ‒ фолликул, 5 ‒ ПАЛМ, 6 ‒ CD-клетки.

В группе животных, получавших МТХ, наблюдалось статистически значимое снижение количества CD3+, CD4+, CD8+ клеток, а также экспрессии CD20+ и площади фолликулов, что свидетельствует об иммуносупрессивном действии данного препарата. В группе животных, получавших «Иммунал» на фоне МТХ, показатели количества CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ оказались статистически значимо выше, чем у животных, получавших МТХ, что свидетельствует об иммунокоррегирующем действии препарата. У животных, получавших СЭЦТ на фоне МТХ, отмечалось заметное улучшение иммунологических показателей по сравнению с группой МТХ, что выражалось в увеличении количества CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+, а также площади ПАЛМ. Введение СЭКТ в условиях метотрексат-индуцированной иммуносупрессии также сопровождалось положительной динамикой большинства показателей: количество клеток CD3+, CD4+ и CD8+, CD20+, площадь ПАЛМ по сравнению с МТХ, при этом значения приближались к уровню интактных животных (табл. 2).

Необходимо отметить, что МТХ оказывал выраженное угнетающее действие на экспрессию CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+, что согласуется с литературными данными о его способности индуцировать супрессию иммунного ответа за счет нарушения пролиферации и дифференцировки лимфоцитов [Saeed et. al., 2024].

Рис. 1. Селезенка мыши, группа ИММ. ИГХ окрашивание на маркер CD3.

Масштабная линейка: 100 мкм [Mouse spleen, IMM group. IHC staining for the CD3 marker. Scale bar, 100 µm]

Рис. 2. Селезенка мыши, группа СЭКТ.

ИГХ окрашивание на маркер CD8.

Масштабная линейка: 100 мкм [Mouse spleen, SECT group. IHC staining for the CD8 marker. Scale bar: 100 µm]

Рис. 3. Селезенка мыши, группа СЭЦТ. ИГХ окрашивание на маркер CD4.

Масштабная линейка: 100 мкм

Рис. 4. Селезенка мыши, группа ИММ.

ИГХ окрашивание на маркер CD20.

Масштабная линейка: 100 мкм [Mouse spleen, IMM group. IHC staining for the CD20 marker. Scale bar, 100 µm]

[Mouse spleen, SECT group. IHC staining for the CD4 marker. Scale bar, 100 µm]

Полученные результаты свидетельствовали о снижении количества клеток в Т- и В-зависимых зонах селезенки и уменьшении их морфометрических характеристик, что отражает структурнофункциональные изменения в иммунной системе при цитостатической терапии. В то же время введение сухих экстрактов клевера и цикория также, как и «Иммунала», способствовало нормализации исследуемых показателей, что может быть объяснено наличием в их составе фенольных соединений, обладающих антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами [Ferreira et. al., 2024]. Выраженность антиоксидантных свойств исследуемых экстрактов, вероятно, объясняется высоким содержанием фенольных соединений, механизм действия которых основан на способности предотвращать повреждающее действие свободных радикалов путем нейтрализации активных форм кислорода и обрыва цепных свободнорадикальных реакций, тем самым снижая уровень оксидативного стресса и повреждения иммунных клеток [Hooper et. al., 2008].

Полученные данные показывают, что растительные экстракты при совместном введении с МТХ способствуют нормализации иммунологических параметров, что свидетельствует об их иммунокоррегиру-ющем действии. Наблюдаемое восстановление численности Т- и В-лимфоцитов согласуется с современными представлениями о механизмах действия фенольных соединений, которые способны оказывать антиоксидантное и противовоспалительное воздействие, регулируя баланс цитокинов и снижая уровень оксидативного стресса [Pavlasova, Mraz, 2020].

Фенольные соединения, содержащиеся в исследуемых экстрактах, оказывают прямое влияние на внутриклеточные сигнальные пути, такие как NF-κB и MAPK, что способствует активации Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, а также поддерживает функциональную активность В-лимфоцитов [Yahfoufi et al., 2018]. Кроме того, показано, что полифенолы способны усиливать антигенпрезентирующую функцию дендритных клеток, что косвенно приводит к увеличению экспрессии CD3+ и CD4+ клеток, а также стимулирует продукцию антител за счет активации CD20+ В-лимфоцитов [Wang et al., 2022].

Таким образом, сопоставление полученных результатов с данными литературы указывает на то, что фитопрепараты, богатые фенольными соединениями, способны нивелировать последствия цитостатически индуцированной иммуносупрессии, что позволяет рассматривать сухие экстракты клевера и цикория как перспективные кандидаты для дальнейших доклинических и клинических исследований в целях разработки средств вспомогательной терапии при иммуносупрессивных состояниях.

Заключение

Современные исследования подтверждают значимость цитостатически индуцированной иммуносупрессии как одной из ключевых проблем клинической фармакологии, ограничивающей терапевтический потенциал использования метотрексата. Известно, что фенольные соединения растительного происхождения рассматриваются как перспективные иммуномодуляторы, обладающие антиоксидантными, противовоспалительными и иммунотропными свойствами. Тем не менее, остаётся нерешенным вопрос их влияния на состав лимфоцитов селезенки, в частности на субпопуляции клеток CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+ в условиях лекарственно индуцированной супрессии.

Результаты проведенного исследования показали, что сухие экстракты травы клевера и цикория, обладающие высоким содержанием фенольных соединений и антиоксидантной активностью, при введении на фоне метотрексата способствуют восстановлению массы животных и селезенки, количества сплено-цитов, количества клеток Т- и В-зон селезенки, нормализации площади лимфоидных фолликулов и ПАЛМ, а также повышению плотности CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+ клеток до уровня интактных животных и группы сравнения, получавших «Иммунал». Полученные данные свидетельствуют о наличии им-мунокоррегирующего потенциала у исследуемых экстрактов, проявляющемся в коррекции нарушений исследуемых показателей иммунитета. Такой эффект может быть обусловлен комплексным действием фенольных соединений, которые участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки лимфоцитов, а также в восстановлении баланса между субпопуляциями иммунных клеток.

Научная значимость результатов заключается в расширении представлений о механизмах иммуно-тропного действия фенольных соединений, а практическая ‒ в возможности использования сухих экстрактов клевера лугового и цикория обыкновенного в качестве потенциальных адъювантных средств для коррекции иммунодефицитных состояний, возникающих на фоне цитостатической терапии.