Исследование токсичности и пирогенности дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб

действующим началом, а наличием в препаратах примесей из-за несовершенства существующей технологии получения ДНК-субстанции из молок рыб.

Целью настоящей работы является исследование токсичности и пирогенности ДНК, выделенной из молок лососевых рыб новым химико-ферментативным способом, и сравнение физико-химических свойств полученного препарата с требованиями Временной Фармакопейной статьи на ДНК-субстанцию препарата «Дезоксинат».

В работе описывается методика получения ДНК из молок лососевых рыб, в основе которой лежит получение нуклеопротеидного комплекса в результате ферментативного расщепления молок, разрушение этого комплекса в солевых условиях при нагревании и осаждение ДНК этиловым спиртом. Отличительной особенностью предла гаемого метода является использование уникального ферментного комплекса «Коллаза», выделенного из гепатопанкреаса камчатского краба [10]. Ферментный препарат обладает протеазной, липазной и нуклеазной активностью, что обеспечивает выход ДНК 4-5% высокой чистоты с содержанием белка не более 1,5%. Показано, что полученная ДНК в основном отвечает требованиям ВФС 42-254795 на ДНК-субстанцию дезокси-ната, является апирогенной и не обладает острой и хронической токсичностью на белых мышах и морских свинках.

Условия эксперимента

Материалы и методы. В работе использовали молоки лососевых рыб, комплекс ферментов из гепатопанкреаса Камчатского краба, химические реактивы марки ХЧ или ОСЧ, наборы фирмы Boehringer Mannheim для опреде- пения аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы и мочевины; фотометр 5010 (Boehringer Mannheim), гомогенизатор «Ultra-Turrax» (Голландия), стеклянную посуду производства России и Германии.

Молекулярную массу ДНК определяли электрофорезом в 4,5% полиакриламидном геле [13]. В качестве стандарта молекулярных масс использовали НаеШ-гидролизат ДНК плазмиды pQPR'. Гиперхромизм, содержание белка определяли по методикам, приведенным в [2].

Методика выделения ДНК из молок лосося [11]. Молоки лосося (1 кг) промывают дистиллированной водой, гомогенизируют в 900 мл 0,15 М раствора хлористого натрия в течение 20 мин при максимальных оборотах ножа гомогенизатора. К гомогенату добавляют 0,4 М раствор динатриевой соли этилен-диаминтетрауксусной кислоты до конечной концентрации 0,020,04 М в зависимости от необходимой степени полимерности получаемого препарата ДНК и гомогенизируют 5 мин. К полученной вязкой массе добавляют ' 1 г комплекса ферментов из гепатопанкреаса Камчатского краба. Смесь инкубируют при 37°С в течение 16 ч, добавляют хлористый натрий до коцентрации 0,5 М, и смесь выдерживают при 56°С в течение 3 ч. Реакционную массу охлаждают, осадок отделяют центрифугированием и ДНК из раствора осаждают добавлением 3 М ацетата натрия (1/10 объема) и этилового спирта (2 объема). Полученный осадок отделяют фильтрацией на нутч-фильтре, промывают этиловым спиртом и высушивают. Выход ДНК — 35-40 г.

Пирогенность, острую и хроническую токсичность определяли по [4,5,14]. Пирогенность изучали на кроликах породы «Шиншилла» с массой тела 22,5 кг. Препараты вводили внут- ривенно из расчета 0,5 мл (0,5% раствор) на кг массы тела животного, температуру тела измеряли через 1, 2 и 3 часа после введения препарата.

Острую токсичность определяли на беспородных белых мышах с массой тела 18-20 г и морских свинках с массой тела 350 г. Токсические эффекты препарата устанавливали при различных способах введения: внутривенном (в/в) и подкожном (п/к) на белых мышах и внутримышечном (в/м) на морских свинках. Испытуемые дозы составляли 125,250 и 375 мг на 1 кг массы тела животного. Контроль интегральных тестов (выживаемость, изменение массы тела подопытных животных, патологические изменения на месте инъекции препарата, поведение, другие внешние признаки) осуществляли во время всего периода эксперимента.

При определении хронической токсичности испытуемые дозы препарата составляли 125 мг/кг, 250 мг/кг и 375 мг/кг. Препарат вводили в/в, п/к белым мышам и в/м морским свинкам, инъекции повторяли на 3-и и 7-е сутки в тех же дозах. Каждую дозу вводили 30 белым мышам и 10 морским свинкам. Группа контрольных животных

Таблица 1

Сравнение физико-химических харктеристик препаратов

Характеристика продукта	Наименование
	Дезоксинат	Препарат
Внешний вид	порошок белого цвета без запаха, гигроскопичен	порошок белого цвета без запаха, гигроскопичен
Растворимость	растворим в воде, практически н/р в спирте, хлороформе, эфире	растворим в воде, практически н/р в спирте, хлороформе, эфире
Молекулярная масса	270000-400000Д	330000-800000Д
Гиперхромизм	37%	36%
Содержание белка в субстанции ДНК	не более 1 %	не более 1,5%

составляла 30 белых мышей и 10 морских свинок, которым вводили по 0,5 мл физиологического раствора в/в, п/к и в/м и подвергали той же процедуре обследования, что и в опыте. Срок наблюдения составлял 14 дней, в течение которых контролировали выживаемость, изменение массы тела подопытных животных, патологические изменения на месте инъекции препарата. Для определения гематологических и биохимических показателей у подопытных животных брали кровь на разных сроках наблюдения.

Полученные результаты исследования обработаны статистическими методами [1,7].

Гематологические и биохимические исследования. Взятие крови у подопытных животных для гематологических и биохимических исследований осуществляли через 24 ч, 5 и 7 суток после однократного введения препарата. Гематологические показатели периферической крови подопытных животных определяли общепринятыми методами, изложенными в [6, 3]. Изменение обменных функций печени и почек контролировали определением в сыворотках крови животных аспартатаминотрансферазы (Е.С.

Таблица 2

Объект исследования	Средняя температура тела животного до опыта (С°)	Температура тела после введения препарата (С°)			Максимальное изменение температуры тела каждого животного (С°)	Сумма максимальных изменений температуры 3-х животных (С°)
		1 ч	2 ч	3 ч
0,5% раствор ДНК	39.0	39.0	39.2	39.3	0.3	0.7
	39.1	39.1	39.2	39.1	0.1
	39.0	39.0	39.3	39.2	0.3
"Дезоксинат"	38.8	39.4	39.7	39.7	0.9	2.7
	38.6	39.0	39.2	39.7	1.1
	38.8	39.5	39.4	39.5	0.7

Таблица 3

Гематологические показатели периферической крови белых мышей после трехкратного п/к введения раствора ДНК на 14-е сутки

Показатели	Дозы ДНК
	125 мг/кг	250 мг/кг	375 мг/кг	контроль
Лейкоциты, 109 кл/л	12.5±0.2	10.9±0.2	13.2+0.4	10.8±0.6
Палочкоядерные нейтрофилы, %	0.5±0.1	0.3±0.2	0.4±0.1	0.4±0.2
Сегментоядерные нейтрофилы, %	18.0±0.5	19.3±0.2	18.8±0.4	18.1±0.3
Эозинофилы, %	0.3±0.2	0.1±0.1	0.2±0.1	0.3±0.2
Моноциты, %	3.2±0.6	3.9±0.4	3.8±0.2	3.5±0.4
Лимфоциты, %	74.0±0.3	76.4±0.4	76.8+0.2	78.7±0.2
Эритроциты, 1012 кл/л	7.6+0.3	8.2±0.2	7.8±0.1	8.5+0.2
Гемоглобин, г/л	152±0.5	163+0.2	160±0.3	162±0.1

Сравнение пирогенности препаратов ДНК

Таблица 4

Биохимические показатели сывороток крови белых мышей в разные сроки после п/к введения раствора ДНК (доза 250 мг/кг)

Показатели	Сроки исследования
	24 ч	7-е сутки	14-е сутки	контроль
Общий белок (г/л)	60.1±0.1	59.5±0.5	62.1 ±0.2	60.4±0.4
Аспартатаминотрансфераза (U/л)	72.5±0.3	74.1 ±0.1	70.5±0.3	69.2±0.5
Аланинамино трансфераза (U/л)	98.7±0.4	101.3±0.2	104.3+0.4	95.1 ±0.4
Мочевина (ммоль/л)	2.8±0.3	2.7±0.1	2.5±0.3	2.4±0.2

2.6.1.1.), аланинаминотрансферазы (Е.С. 2.6.1.2.) и мочевины. Общий белок определяли стандартным биуретовым методом [12].

Результаты и обсуждение

ДНК, полученная из молок лососевых рыб по разработанной методике, была охарактеризована по физико-химическим параметрам в сравнении с препаратом «Дезоксинат» (дезоксирибо-

Таблица 5

Гематологические показатели периферической крови морских свинок после трехкратного в/м введения раствора ДНК на 14-е сутки

Показатели	Дозы ДНК
	125 мг/кг	250 мг/кг	375 мг/кг	контроль
Лейкоциты, 109кл/л	9.5±0.4	9.9±0.2	12.2±0.1	9.8±0.2
Палочкоядерные нейтрофилы, %	0.4±0.1	0.2±0.2	0.3+0.1	0.4±0.3
Сегментоядерные нейтрофилы, %	33.0+0.5	30.1 ±0.3	34.2+0.3	33.2±0.2
Эозинофилы, %	2.4±0.2	1.8±0.1	2.2±0.2	2.3+0.2
Моноциты,%	2.6±0.6	2.2±0.3	2.4±0.1	2.5±0.3
Лимфоциты, %	62.1+0.3	65.7+0.1	60.9±0.3	61.6±0.2
Эритроциты, 1012 кл/л	5.6±0.3	6.1 +0.3	6.6+0.5	6.8±0.2
Гемоглобин, г/л	87±0.5	85±0.2	92±0.3	88±0.2
нуклеат натрия), утвержденным ДНК растворяли в стерильном не превышало 0,3°С, и сумма в качестве субстанции для по- апирогенном физиологическом максимальных колебаний тем-

лучения медицинских препаратов [2]. Результаты исследования (табл. 1) показали, что оба препарата не отличаются по внешнему виду, растворимости и гиперхромизму. Вместе с тем полученная по предлагаемой методике ДНК представляет собой набор фрагментов с более широким диапазоном молекулярной массы, чем субстанция «Де-зоксинат». Несколько выше в нашей субстанции и содержание белка.

Для изучения пирогенности растворе до конечной концентрации 5 мг/мл (0,5%) и после стерильной двустадийной ультрафильтрации через мембранные фильтры 0,45 мкм и 0,22 мкм полученный раствор вводили внутривенно из расчета 2,5 мг ДНК на кг массы тела животного (1,5 мл 0,5% раствора ДНК).

Было установлено (табл. 2), что 0,5% раствор ДНК, полученной по нашей методике, не вызывает пирогенных реакций. Максимальное повышение температуры тела каждого кролика пературы у трех кроликов (те. условный лихорадочный индекс) составляла 0,7°С, что соответствует требованиям, предъявляемым к инъекционным препаратам Государственной и Европейской Фармакопей по пирогенности [4,14].

Используемый для сравнения фармокопейный препарат «Дезоксинат» вызывает существенное повышение температуры и условный лихорадочный индекс составляет 2,7°С (табл. 2). Полученные результа-

Таблица6

Биохимические показатели сывороток крови морских свинок в разные сроки после в/м введения раствора ДНК (доза 250 мг/кг)

Показатели	Сроки исследования
	24 ч	7-е сутки	14-е сутки	контроль
Общий белок (г/л)	50.1 ±0.2	48.1 ±0.2	52.0±0.4	48.5±0.4
Аспартатаминотрансфераза (U/л)	74.5±0.4	72.7±0.6	63.5±0.6	66.3±0.1
Аланинамино трансфераза (U/л)	88.3±0.3	90.3±0.4	93.9±0.3	87.5±0.3
Мочевина (ммоль/л)	3.0±0.1	3.3±0.1	2.9±.4	3.1 ±0.2

Примечание: Достоверность различий между группами р<0.05.

ты позволяют заключить, что пирогенность препарата не является свойством ДНК, а обусловлена наличием в нем пирогенных примесей. Предлагаемая методика позволяет получать субстанцию, свободную от таковых.

Изучение острой и хронической токсичности проводили с использованием предполагаемых терапевтических и увеличенных по сравнению с ними на порядок доз. При однократном и трехкратном введении препарата беспородным белым мышам в/в, п/к и морским свинкам в/м в опытах не наблюдалось токсикогенных проявлений. Однократное или трехкратное введение доз 125, 250, 375 мг/кг внутривенно или подкожно беспородным белым мышам и внутримышечно морским свинкам не вызывало гибели и снижение массы тела у лабораторных животных. На месте инъекции препаратов патологические изменения (абсцессы, некрозы) отсутствовали. Коэффициенты прироста массы тела в течение эксперимента также не отличались от контроля.

Гематологические показатели периферической крови экспериментальных животных (белые беспородные мыши, морские свинки) через 24 ч, 7 суток после однократного введения (данные не представлены) и на 14-е сутки после трехкратного введения раствора ДНК (табл. 3, 5) не отличались от показателей контрольной группы, также, как и биохимические показатели сывороток крови экспериментальных и контрольных животных (табл. 4, 6).

Таким образом, выделение ДНК с помощью ферментного комплекса «Коллаза» из гепатопанкреаса Камчатского краба позволяет получить ДНК-содер-жащий препарат без токсических свойств и соответствующий требованиям к инъекционным лекарственным средствам.