Исследование токсичности проб урбаноземов, загрязненных тяжелыми металлами

«датчиком», чувствительным к веществам различной химической природы; следовательно, для гарантированного выявления в среде токсического агента должен использоваться набор биотестов и биоиндикаторов, представляющих организмы различных таксономических групп [4, 15, 30].

На результаты биотестирования и биоиндикации влияют как характер загрязнения, так и выбор тест-организма. Это известный в биотестировании феномен, обусловленный видовыми, в частности, биохимическими особенностями реакциями организмов [19]. Почва является наиболее сложным объектом биодиагностики [28]. Ее геохимические особенности, сложившиеся в ходе естественного почвообразования, отражаются на ответных реакциях организмов. Распространена ситуация несогласованности данных химических и биологических анализов. Причиной этого может быть действие буферных систем почвы. Например, буферность по отношению к тяжелым металлам (ТМ) формируется в результате совокупности физикохимических свойств почвы, понижающих подвижность ионов ТМ, а, следовательно, и их биодоступность [1, 13, 24, 35].

Цель работы: исследование токсичности образцов урбаноземов, загрязненных соединениями некоторых ТМ, различными методами.

Материалы и методы исследований. В качестве объекта биодиагностики и необходимых химических анализов использовали пробы урбаноземов, отобранных в районе воздействия металлургического предприятия ОАО «Электроцинк» (Россия, Республика Северная Осетия-Алания, г. Владикавказ). Данные о химическом загрязнении проб соединениями ТМ, содержании органического вещества и кислотности приведены в табл. 1. Пробы отобраны в августе 2015 г. с глубины 0-5 см в непосредственной близости (проба 5) и по мере удаления на юго-запад от ОАО «Электроцинк» (рис. 1). Отбор проб с территории участков проводили методом «конверта». Площадь участков определялась исходя из удобства пробоотбора и относительного однообразия структуры урбанозема в пределах одного участка. С каждого участка отобрано по 5 точечных проб. Участки пробоотбора находятся в общей доступности для населения, поэтому требуют не только исследования химического состава, но и биодиагностики с последующим выбором методов ремедиации [5, 10]. Валовое содержание ТМ в образцах урбано-земов определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС) [32]. Содержание органического вещества определяли фотометрически по методу Тюрина в модификации ЦИНАО: по количеству образовавшегося иона Cr3+ [6]. Кислотность определяли потенциометрически в водной и солевой вытяжках [2].

Рис. 1. Участки отбора проб урбаноземов

Для характеристики интегральной степени загрязнения образцов урбаноземов соединениями ТМ рассчитывали суммарный показатель загрязнения (СПЗ), представляющий собой сумму превышений коэффициентов концентраций ТМ, по формуле: Z с = хk k – (n–1), где k к – коэффициент концентрации (показатель кратности превышения содержания ТМ в точке опробования над его средним содержанием в аналогичной природной среде на фоновом участке), n – число аномальных элементов [26]. Полученные показатели интегральной оценки загрязнения почв характеризовали степень загрязнения: СПЗ > 128 – чрезвычайное загрязнение, СПЗ = 32–128 – опасное загрязнение; СПЗ = 16–32 – умеренно опасное загрязнение; СПЗ <16 – допустимое загрязнение.

Биоиндикацию состояния урбаноземов проводили исследованием альго-циано-микологических комплексов в чашечных культурах. Использовали метод инициированного микробного сообщества, развивающегося в результате увлажнения исследуемых образцов. Пробы помещали в стерильные 3-х-секторные чашки Петри. Масса образца в одном секторе – 7 г. Почву увлажняли до 70% от полной влагоемкости, выравнивали и раскладывали покровные стекла (стекла обрастания). Численность цианобактерий (ЦБ), зеленых и диатомовых водорослей (В) и микромицетов (ММ) проводили методом прямого учета под микроскопом через 40 суток экспозиции в люминостатах с 8часовым освещением 3200 люкс. При учете дополнительно проводили дифференцировку популяций мик-ромицетов на формы с бесцветным и окрашенным мицелием.

Интегральную токсичность определяли по двум аттестованным экспресс-методам биотестирования: по изменению хемотаксической реакции инфузорий Paramecium caudatum с помощью прибора «Биотестер-2» [33] и по изменению биолюминесценции бактериальной тест-системы «Эколюм» с помощью прибора «БИОТОКС-10М» [23]. Методы позволяют дифференцировать группы токсичности: по тест-системе

«Эколюм»: I – проба не токсична, II – проба средне токсична, III – проба сильно токсична; по Paramecium caudatum I – допустимая степень токсичности, II – умеренная степень токсичности, III – высокая степень токсичности. В качестве биотестов для оценки отклика микрофототрофных организмов использовали тетра-зольно-топографический метод, основанный на изменении дегидрогеназной активности цианобактерий рода Nostoc : проба оценивается как токсичная, если отклонение от контроля составляет 50% и более [8].

Математически обработанные результаты приводим в виде M±S , где M – среднее арифметическое, S – стандартное отклонение. Достоверность различий сравниваемых значений доказывали с использованием критерия Стьюдента с учетом уровней значимости ( p ), вычисленных для двух сравниваемых значений. Наличие корреляционной зависимости устанавливали по коэффициенту Пирсона (r). Для расчетов использовали Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение. Исследуемые образцы урбаноземов характеризуются значениями рН, близкими к нейтральному уровню. Содержание органического вещества колеблется в пределах от 2,2% до 11,5%. Основной особенностью проб является их высокое загрязнение соединениями ТМ. Во всех образцах установлено сверхнормативное содержание свинца: кратность ПДК варьировала от 1,2 для пробы №1 до 92 для пробы №5. Норматив содержания цинка превышен в 12-37,5 раз во всех пробах, кроме пробы № 1. В половине исследуемых проб установлено превышение содержания меди по сравнению с допустимыми нормами (табл. 1).

По суммарному показателю загрязнения наиболее загрязненными оказались пробы №4 и №5, что вполне логично, так как участки их пробоотбора расположены ближе всех остальных к предприятию-загрязнителю. СПЗ для них составил 57,6 и 129,1 соответственно, характеризуя степень загрязнения почвы как опасную и чрезвычайно опасную (табл. 2).

Таблица 2. Степень загрязнения проб урбаноземов г. Владикавказа по показателю суммарного загрязнения

Степень загрязнения	СПЗ	№ проб
допустимая	< 16	2
умеренно опасная	16–32	1, 3
опасная	32–128	4
чрезвычайно опасная	> 128	5

Таблица 1. Характеристика проб урбаноземов г. Владикавказа

№ пробы	р Н н2о	рН KCl	Содержание органического вещества, %	Валовое содержание ТМ, мг/кг					СПЗ
				Fe общее	Cu	Ni	Zn	Pb
1	7,02	5,93	2,7±0,5	31000±170	14,5±0,7	28,57±0,24	59±4	35,51±0,10	26,5
2	6,55	5,53	7,3±0,7	31800±1000	44,4±0,6	30,1±0,8	1165±12	325,5±11	1,2
3	7,31	6,46	11,5±1,1	29660±320	62,5±0,7	31,1±1,5	1468±18	405±7	21,1
4	7,60	6,93	11,0±1,1	17080±210	100,5±0,8	28,4±0,9	1985±21	1240±110	57,6
5	6,60	6,06	5,0±0,7	35070±360	383,8±1,8	31,6±0,4	3750±90	2760±230	129,1
ПДК*	—	—	—	25000*	55	85	100	30	—

Примечание: прочерк обозначает, что норматив отсутствует. Жирным шрифтом выделены значения, превышающие норматив, * – действующий норматив [25]; СПЗ – суммарный коэффициент загрязнения почвы

Результаты биоиндикации. Количественный учёт различных водорослей, ЦБ и микромицетов показал, что их природный пул в исследуемых почвах сравнительно невелик (табл. 3-4), так как даже инкубация почвенных образцов более месяца в оптимальном режиме влажности, температуры и освещения не привела к феномену «цветения», что, как правило, наблюдается в луговых, лесных, агрогенных и городских почвах за этот период. Из водорослей развивались только одноклеточные зеленые (в диапазоне от 57 до 125 кл./см ² ) и диатомовые (с колебаниями численности клеток по почвенным образцам на 1 см ² от 92 до 150). Суммарная численность водорослей была в пределах 149–275 кл./см ² . Минимальное развитие водорослей характерно для почвенного образца № 5, максимальное – для пробы образца урбанозема №2. В остальных вариантах численность этой группы фототрофов была приблизительно одинаковой (табл. 3).

Коэффициент корреляции между суммарным показателем загрязнения и общей численностью фототрофов (0,98) свидетельствует о тесной зависимости между накоплением ТМ урбаноземами и формированием сообщества фототрофных эукариотных микроорганизмов. Известно, что эффекты ТМ на представителей микроэдафона могут варьировать в пределах прямо противоположных реакций. Считают, что изменения отдельных групп почвенных микроорганизмов являются достоверными в тех случаях, когда концентрации загрязнителей, в частности, ТМ, на два порядка превышают фоновую. В то же время существуют доказательства того, что численность различных групп микроорганизмов проявляет очень высокую вариабельность и может происходить как падение, так и возрастание данного показателя [14]. Более четкая реакция характерна для физиолого-биохимических показателей. Так, при повышении концентрации ТМ наблюдается резкое снижение активности ферментов: амилазы, дегидрогеназы, уреазы, инвертазы, каталазы [37], а также численности отдельных групп микроорганизмов [34].

Микроорганизмы, входящие в состав почвенных комплексов, обладают разной степенью устойчивости к ТМ. Сравнение обилия фототрофных микроорганизмов и их вклада в фототрофную структуру популяции показывает, что абсолютное доминирование в фото-трофных микробных комплексах урбаноземов г. Владикавказа принадлежит ЦБ (табл. 3, 5). Данный феномен получил название «цианофитизация» и отмечен для почв многих техногенных и урбанизированных территорий [12]. Максимальное развитие ЦБ отмечено в образцах №4 и №5. Именно в этих образцах участие ЦБ в сложении фототрофных комплексов достигает 97,2% и 99% соответственно. Сравнение полученных цианобактериальных биоиндикационных показателей с показателями интегральной оценки загрязнения почв (табл. 2) позволяет судить о высокой степени загрязнения (опасная и чрезвычайно опасная) образцов урбаноземов №4 и №5.

Таблица 3. Численность фототрофных микроорганизмов в почвах г. Владикавказа, кл./см ²

№ пробы	Водоросли		Водоросли (всего)	Цианобактерии	Фототрофы (всего)
	зеленые	диатомовые
1	75±25	107±12	182±37	1032±75	1214±112
2	125±25	150±25	275±50	925±75	1200±125
3	107±25	107±25	214±50	1275±125	1489±175
4	107±25	93±12	200±37	6857±600	7057±637
5	57±10	92±12	149±22	14232±2250	14381±2272

Микроорганизмы, входящие в состав почвенных комплексов, обладают разной степенью устойчивости к ТМ. Сравнение обилия фототрофных микроорганизмов и их вклада в фототрофную структуру популяции показывает, что абсолютное доминирование в фото-трофных микробных комплексах урбаноземов г. Владикавказа принадлежит ЦБ (табл. 3, 5). Данный феномен получил название «цианофитизация» и отмечен для почв многих техногенных и урбанизированных территорий [12]. Максимальное развитие ЦБ отмечено в образцах №4 и №5. При этом именно в этих образцах участие ЦБ в сложении фототрофных комплексов достигает 97,2% и 99% соответственно. Сравнение полученных цианобактериальных биоиндикационных показателей с показателями интегральной оценки загрязнения почв (табл. 2) позволяет судить о высокой степени загрязнения (опасная и чрезвычайно опасная) образцов урбаноземов №4 и №5.

Негативные последствия влияния ТМ сказываются также и на развитии грибов в почвенных образцах (табл. 4), где их численность определяется всего лишь в несколько сотен пропагул (в данном случае фрагментов мицелия) на 1 см3 как правило, в почвах с естественным фоном ТМ этот показатель варьирует в пределах от нескольких тысяч до десятков и сотен тысяч на 1 см3 [9]. Диагностическим признаком при использовании микромицетов в биоиндикационных целях является соотношение в структуре популяций грибов с бесцветным и окрашенным мицелием [17]. Если данный показатель превышает 50-60%, то велика вероятность интерпретирования результатов химическим загрязнением почв, поскольку именно меланинам принадлежит роль у грибов в адаптации к различным неблагоприятным химическим факторам. В частности, существуют доказательства связывания ТМ меланиновыми пигментами грибов [27]. Ингибиторы биосинтеза меланина удаляют пигменты с поверхности клеток грибов. В отсутствие меланина у микромицетов могут наблюдаться: ограничения роста, нарушение морфологии и целостности клеточной стенки при высокой концентрации ТМ [36]. По признаку меланизации во всех образцах урбаноземов преобладают формы грибов с окрашенным мицелием (табл. 5). Максимальный показатель (70,9%) темно-окрашенных грибов зарегистрировали в образце №5.

Таблица 4. Численность микроскопических грибов в почвахг. Владикавказа, пропагул/см ²

№ пробы	Микромицеты с мицелием		Всего
	бесцветным	окрашенным
1	132±25	217±50	349±75
2	125±25	217±50	342±75
3	132±12	250±10	382±22
4	142±12	200±25	342±37
5	82±12	200±25	282±37

Таблица 5. Структура микробных популяций (%)

№ пробы	Водоросли	Цианобактерии	Бесцветные грибы	Окрашенные грибы
1	15,0	85,0	37,8	62,2
2	22,9	77,1	36,5	63,5
3	14,4	85,6	34,5	65,5
4	2,8	97,2	41,5	58,5
5	1,0	99,0	29,1	70,9

Полученные результаты свидетельствуют об экологическом неблагополучии исследуемых почвенных образцов. Эффект цианофитизации фототрофных комплексов выражен во всех вариантах. Цианобактериальный компонент в этих комплексах составляет от 75 до 99 %. Практически полное доминированием среди ЦБ принадлежит различным видам рода Phormidium . Азотфиксирующие формы встретились только в пробе №3. Меланизация микокомплексов также наблюдается во всех вариантах с доминированием окрашенных форм грибов от 55% до 72%.

Биотестирование по аттестованным экс-пресс-методам. В результате биотестирования проб по изменению хемотаксической реакции P.caudatum все образцы кроме пробы №4 были отнесены ко II группе токсичности из трех возможных, – «умеренная степень токсичности» [33] (табл. 6). Острая токсичность пробы №5 наиболее закономерна, поскольку ей соответствует максимальный из установленных СПЗ (121,1). Участок отбора пробы №3, несмотря на некоторое отдаление от ОАО «Электроцинк», характеризуется высоким СПЗ равным 21,1. Токсичность образцов № 1 и 2, вероятно, связана с пониженным относительно установленных для территории значений содержанием органического вещества (табл. 1). Известно, что важная роль в закреплении металлов в почве принадлежит органическому веществу [1]. Так для пробы №1 показатель равен 2,7±0,5% – это минимальное из установленных значений. Проба №4 признана в соответствии с методикой не токсичной [33], однако значения индекса токсичности близки к критическому уровню: критерий отнесения пробы ко II группе – индекс токсичности 0,40 у.е. и выше. По суммарному показателю загрязнения ТМ участок № 4 признан обладающим опасной степенью загрязнения.

По бактериальной тест-системе «Эколюм» в целом все пробы оказались не токсичны, наблюдалась незначительная стимуляция биолюминесценции относительно контроля (табл. 6). Такая невыраженная реакция тест-системы на высокое загрязнение может быть связана с инверсией ответной реакции, то есть изменением отклика со стимуляции биолюминесценции на угнетение данной тест-функции. К сожалению, аттестованная методика [23] не предполагает интерпретации отрицательных значений индексов токсичности (стимуляции). Однако, ранее в модельных экспериментах с водными и почвенными средами показано, что даже значительные уровни загрязнения могут вызывать стимуляцию «Эколюм» [20]. Безусловно, инверсия ответной реакции является значительным недостатком методики. При этом практически любой токсический процесс, за исключением реакции на супертоксиканты, проходит через стадии стимуляции, критического диапазона и угнетения жизненных показателей [16]. В случае методов биотестирования важно, чтобы инверсии не происходило в диапазоне концентраций загрязняющих веществ, превышающих пределы нормирования.

Анализируя полученные результаты, приходим к заключению, что реакция оцениваемых тест-систем во многих случаях закономерна, но является слабой по сравнению с установленными уровнями загрязнения ТМ. Для раскрытия причины этого явления приводим данные по соотношению валовых форм свинца и цинка и их водорастворимых форм (табл. 7). Определение водорастворимых форм обусловлено тем, что для токсикологического анализа используется водная почвенная вытяжка, соответственно тест-организмы воспринимают воздействие только той доли соединений ТМ, которые в силу физико-химических свойств перешла в экстракт.

Таблица 6. Токсичность проб урбаноземов г. Владикавказа

№ пробы	Тест-система «Эколюм»	Тест-объект Paramecium caudatum, Т (у.е.)	Дегидрогеназная активность ЦБ рода Nostoc , % отклонения от контроля
1	(-39,9±3,0)* I группа	0,45±0,09 II группа	-23,5±1,4**
2	(-41±9)* I группа	0,43±0,09 II группа	5,8±0,4
3	(-39,9±3,0)* I группа	0,51±0,01 II группа	-29,3±1,2**
4	(-63±5)* I группа	0,32±0,05 I группа	-81±4**
5	(-37,6±1,1)* I группа	0,40±0,05 II группа	-100,0±0,5**

Примечание: * – стимуляция биолюминесценции; ** - угнетение дегидрогеназной активности. Наименование групп токсичности приведено в «Объектах и методах». Жирным шрифтом обозначены значения, соответствующие заключению «проба токсична»

Таблица 7. Соотношение валовых и водорастворимых форм ТМ в образцах урбаноземов

№ пробы	Zn вал. /Zn вод.	Pb вал. / Pb вод
1	1735	106
2	1532	1550
3	772	2250
4	992	6200
5	572,5	6900

Примечание: Zn вал. – валовое содержание цинка (мг/кг), Zn вод. – содержание водорастворимых форм цинка; аналогичные обозначения применены для свинца

Соотношения валового содержания металлов и их водорастворимых форм колоссально (табл. 7). В водную вытяжку переходит менее 0,1% от количества валовых форм элемента. Цинк мигрирует в водный раствор в диапазоне 0,05-0,2%, медь 0,1-2,3% от валового содержания. Никель методом ААС в водной вытяжке не обнаружен. Корреляционный анализ связи количества органического вещества в образцах и содержания водорастворимых форм металлов показал: накопление нелабильных форм меди наиболее тесно связано с долей органического вещества (r<-0,7). Для других металлов зависимость слабее, что объясняется химическими особенностями каждого элемента и его форм. Например, доказано, что цинк связывается с органическим веществом почвы неспецифически и более подвижен по сравнению со свинцом и медью [29].

Известно, что ионы ТМ имеют большое сродство к органическому веществу почвы [9, 16]. Для Pb, Cu и Ni авторами показаны высокие значения констант устойчивости их органоминеральных соединений с фульво-и гуминовыми кислотами [21]. Причем, чем ниже содержание металла, тем выше энергия их связывания [38]. Большой вклад в изменение биодоступности ТМ может вносить уровень рН почвы: повышение кислотности создает условия перехода нелабильных форм металлов в подвижные [7]. При исследовании урбано-земов г. Владикавказа этот факт наиболее убедительно подтвердился для меди: коэффициент корреляции между степенью извлечения соединений меди водной вытяжкой и обменной кислотностью урбаноземов составил (-0,84). Для других элементов аналогичной зависимости выявить не удалось, что объясняется тем, что диапазон значений рН был не велик и близок к нейтральной реакции среды (6,6-7,6 ед. рН). Этим, отчасти, объяснимы результаты биотестирования с помощью классических тест-объектов, P.caudatum и тест-система «Эколюм» чувствительны к ТМ, однако специфика реализации методики биотестирования (тестируются водные вытяжки), большая буферная емкость почвы, возможный переход в водную вытяжку лигандов, уменьшающих активную концентрацию ионов ТМ и как следствие их биодоступность [31], определяют результат определения токсичности, который в свою очередь не согласуется с данными о высочайшем содержании ТМ в тестируемом образце урбанозема (табл. 1).

Биотестирование тетразольно-топографи-ческим методом. Исследование токсичности по реакции почвенных ЦБ рода Nostoc показало, что вещества, содержащиеся в водных вытяжках из проб, отобранных на близлежащих к ОАО «Электроцинк» участках (№4, №5) значительно угнетают дегидрогеназную активность микроорганизмов (на 81 и 100 % соответственно), данные пробы признаны токсичными (табл. 6). Суточная экспозиция культуры с водными вытяжками из проб № 1-3 не оказала влияния, интерпретируемого как токсичность.Реакция ЦБ коррелирует с валовым содержанием ТМ (r=0,93). Однако, как и при использовании аттестованных методов биотестирования, для некоторых участков высокие суммарные показатели загрязнения не вызывают критического ответного угнетения дегидрогеназной активности ЦБ. Например, образцы с участков № 1 и 3 угнетают ЦБ на 23,5±1,4 и 29,3±1,2 % по сравнению с контролем, тогда как соответствующие СПЗ равны 26,5 и 21,1, что характеризуется как умеренно опасная степень загрязнения [26]. Отличие тест-отклика ЦБ от отклика тест-объектов аттестованных методик объяснимо отличием в морфологии и функционировании биохимических систем. Данные тест-организмы оказались более чувствительными за счет иного функционирования в среде, содержащей соединения ТМ. Например, известно, что лиганды органической природы увеличивают биодоступность ионов меди для почвенных ЦБ, что способствует проявлению токсического эффекта [26].

Заключение и выводы. По результатам химического анализа 5 образцов урбаноземов г.Владикав каза видно, что самая высокая степень загрязнения ТМ присуща образцу №5 – чрезвычайное загрязнение. Сравнение используемых в данной работе пяти биоди-агностических методов (2-х биоиндикационных и 3-х биотестовых) с результатами химического анализа показало, что наиболее чувствительными методами являются метод биотестирования по определению де-гидрогеназной активности ЦБ и методы биоиндикации, основанные на определении степени доминирования ЦБ и степени доминирования меланизирован-ных грибов в структуре альго-циано-микологических комплексов. Исследование токсичности одних и тех же объектов, но с использованием различных подходов (биотестирование и биоиндикация) позволяет по-разному судить о состоянии изучаемого объекта. Это уникальное явление, показывающее своеобразие всех живых существ и одновременно актуальная проблема, решение которой необходимо для правильной оценки экологического риска. Сопоставление результатов химических анализов и биодиагностики исследуемых проб урбаноземов демонстрирует проблему, которая сопутствует изучению почв различной типологии: загрязняющие вещества в компонентах окружающей среды представлены биодоступными и бионедоступ-ными формами, что затрудняет интерпретацию получаемых данных.

Пробы урбаноземов, отобранных на территории г. Владикавказа, загрязнены соединениями меди, свинца, никеля и цинка до опасного и чрезвычайно опасного уровней, однако такое состояние не отразилось в равной мере на использованных тест-объектах. Высокую степень токсичности удалось однозначно выявить по состоянию аборигенной микрофлоры: одноклеточные зеленые водоросли были представлены только зелеными и диатомовыми водорослями, на фоне ярко выраженного эффекта цианофитизации сообщества (до 99%) наблюдалось отсутствие азотфик-сирующих форм, меланизация микокомплексов достигала 70,9%. Оценка тех же проб с помощью аттестованных экспресс-методик биотестирования, привела к выводу об отсутствии существенного уровня токсичности. Биотестирование по угнетению дегидрогеназной активности ЦБ р. Nostoc показало наиболее сопоставимые с химическим анализом результаты: снижение показателя более, чем на 50 %, по сравнению с контролем, наблюдалось в вытяжках из наиболее загрязненных образцов.

В целом результаты определения интегральной токсичности показывают, что бесконтактный способ исследования не дал результатов сопоставимых со степенью загрязнения образцов, что обусловлено буферными свойствами почвы, определяющими низкий уровень экстракции соединений ТМ водной вытяжкой из проб. В свою очередь, тестирование одной и той же вытяжки, но различными тест-объектами показывает различную силу отклика, что объясняется морфофункциональными различиями тест-организмов. Методы биотестирования, безусловно, привлекательны для исследователей относительной простотой операций анализа, экспрессностью, возможностью дифференциации проб по степени токсичности. Биоиндика-ционные подходы дают представление о реальной ситуации в экосистеме, включая адаптационные возможности населяющих её организмов. При этом биоиндикация, основанная на глубоком изучении экологических групп и видов сообщества, требует высокой квалификации исполнителя.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для молодых российских ученых №МК-3964.2015.5.