Исследование уровня матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови здоровых мужчин разного возраста при воздействии факторов риска

Изучение процессов, приводящих к старению, представляет собой чрезвычайный интерес сегодня. Такой сложный и многофакторный процесс может протекать совершенно по-разному. В одном случае это физиологическая этапность без инвалидизации, тогда как в другом – набор так называемых возрастных заболеваний. К ним относятся атеросклероз, болезнь Альцгеймера и артериальная гипертензия [1–3].

На сегодняшний день нет единой теории старения. Большинство из них базируются на изучении отдельных процессов, происходящих при старении организма [4–7]. Эти теории объясняют процессы, приводящие к функциональным и структурным сосудистым изменениям, таким как ремоделирование внутриклеточного матрикса, усиление жёсткости артерий. Возрастные патологические изменения сосудистой сети играют решающую роль в заболеваемости и смертности пожилых людей. В последние годы успехи в изучении биологии сосудов позволили установить вклад молекулярных механизмов в микросо-судистое старение [8]. Они могут протекать физиологически или быть преждевременно спровоцированы при действии так называемых факторов риска (ФР).

Наибольший интерес в перспективе разработки профилактических мер представляют модифицируемые факторы риска, такие как величина артериального давления (АД) свыше 145 мм рт. ст., нарушения в липидном профиле, избыток отложения внутрибрюш-ного жира, вредные привычки, отсутствие умеренной ежедневной физической нагрузки [8].

Как показали исследования последних 20 лет, сами молекулярные механизмы, приводящие к микрососу-дистому старению, во многом основываются на активности матриксных металлопротеиназ (ММП) [6, 7]. ММП представляют собой группу цинковых металлопротеиназ, функция которых связана с обменом белков межклеточного матрикса [10]. Эта группа белков способствует патогенезу различных заболеваний через регуляцию внутриклеточного матрикса [2]. Ряд авторов показали, что экспрессия ММР-9, которая увеличивается с возрастом, влияет на структурное ремоделирование стенки аорты и старение сердца [3, 11]. Также установлено участие матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в патогенезе артериальной гипертензии, атеросклероза, аневризм аорты и инфаркта миокарда [3]. Однако P. Cancemi с соавт. (2020) в своём исследовании показали, что в целом старение связано с повышением активности

ММП-2 у долгожителей, а концентрация ММП-9 сильно варьирует с возрастом [10].

Цель исследования – изучить в разных возрастных группах условно здоровых мужчин изменения уровня отвечающих за ремоделирование сосудистой стенки матриксных металлопротеиназ (ММП-1, ММП-2, ММП-3, ММП-7), их тканевых ингибиторов ТИМП-1 и ТИМП-2, комплексов ММП-9/ ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-2, учитывая наличие или отсутствие модифицируемых факторов риска болезней системы кровообращения.

Объект и методы

В нашем исследовании приняли участие условно здоровые мужчины в количестве 151 человека, из которых, согласно классификации ВОЗ, мы выделили четыре возрастные группы: 30 (20%) мужчин – молодого возраста; 41 (27%) – среднего возраста; 62 (41%) – пожилого возраста; 18 (12%) – старческого возраста.

Включённые в исследование условно здоровые мужчины были распределены в две основные группы – без сопутствующих модифицируемых факторов риска развития сердечно-сосудистой патологии и с наличием таковых. Принцип формирования групп – параллельный, открытый, сравнительный, когортный.

Все обследования и забор материала проводились в утреннее время (8–12 ч.), в летне-осенний период. Определение содержания ММП, их тканевых ингибиторов и комплексов ММП-9/ТИМП-1, ММП-9/ТИМП-2 в сыворотке крови проводили методом сэндвич-варианта твердофазного ИФА с помощью специфических реактивов фирмы «R&D Diagnostics Inc.» (США), для определения ММП-9 использовали реактивы фирмы Cloud-clone corp. (КНР) согласно прилагаемым инструкциям. Учёт результатов производили с помощью иммуноферментного анализатора «Multiscan» (Финляндия). Расчёты количества металлопротеиназ, их ингибиторов и комплексов проводили путём построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в нг/мл или пг/мл. Дополнительно рассчитывали коэффициенты ММП к их ингибиторам (например, как частное от деления ММП-3:ТИМП-1; ММП-3:ТИМП-2).

Помимо целевых, у каждого были зафиксированы следующие показатели: рост, вес, окружности талии, шеи, плеча, запястья, бёдер; результаты клинического и биохимического анализа крови, включая уровень глюкозы, креатинина, холестерина, липопротеинов, триглицеридов, общего билирубина, АЛТ, АСТ, СРБ, общего белка. Инструментальная диагностика характеризовалась проведением электрокардиографии, эхокардиографии, рентгенографии органов грудной полости.

Для диагностики метаболического синдрома у пациентов использовались следующие критерии:

• •    окружность талии более 94 см;

• •    уровень артериального давления свыше 140 и 90 мм рт. ст.;

• •    уровень триглицеридов свыше 1,7 ммоль/л;

• •    уровень ЛПВП менее 1,0 ммоль/л;

• •    уровень гликемии натощак свыше 6,1 ммоль/л.

При наличии трёх и более критериев у пациентов диагностировался метаболический синдром.

Таким образом, все исследуемые были разделены на четыре возрастные группы, которые, в свою очередь, распределили на две подгруппы:

А – условно здоровые, нормальные показатели артериального давления, отсутствие признаков метаболического синдрома, некурящие;

Б – условно здоровые, нормальные показатели артериального давления, наличие признаков метаболического синдрома и/или курение.

Статистическая обработка материала проведена методом непараметрической статистики (с использованием программного обеспечения SPSS v26). Данные выражали – Me, нижний и верхний квартиль. Достоверность различий рассчитана с использованием критерия Манна – Уитни – Вилкоксона; определён коэффициент корреляции Спирмена.

Результаты исследования

При анализе системы матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов нами было обнаружено, что в общих группах, без учёта фактора риска, показатель ММП-1 в сыворотке крови мужчин старше 75 лет был наиболее высоким в сравнении с более младшими возрастными группами (рис. 1). Тогда как в молодом возрасте ММП-2 был ниже, чем в пожилом (р 1-3 = 0,05). Различий уровня ММП-3 в зависимости от возраста не выявлено. Были отмечены более высокие уровни ММП-7 у мужчин до 75 лет (рис. 1). Также отмечался рост уровня ММП-9 в молодом, среднем и старческом возрасте (р 1-3 = 0,032; р 2-3 = 0,038, р 1-4 = 0,028; р 2-4 = 0,034, рис. 1). Зафиксирован более высокий уровень ТИМП-1 в группе среднего возраста по сравнению с другими возрастными группами.

Говоря о комплексе ММП-9/ТИМП-2, его значения наиболее низкими были у людей всех возрастных групп, кроме молодого возраста (табл. 1).

Изучая показатели в зависимости от наличия или отсутствия ФР в группе молодого возраста были определены более высокие показатели ММП-7 (р 1-2 = 0,039) и ТИМП-1(р 1-2 = 0,023) (табл. 2). Уровень ММП9/ТИМП-2 в сыворотке крови у мужчин молодого возраста без ФР был ниже в 1,6 раза (р 1-2 = 0,0012), а комплексов ММП-9/ТИМП-1 – в 1,3 раза (р 1-2 = 0,045). У молодых мужчин с ФР были ниже показатели ММП-1 (р 1-2 = 0,044), ТИМП-1(р 1-2 = 0,023), а значение ММП-9 ниже в 2,2 раза (р 1-2 = 0,0023) (табл. 2).

А

Молодой возраст Средний возраст Пожилой возраст Старческий возраст

Б

Рисунок 1. Показатели системы металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов у условно здоровых мужчин разного возраста (медианные значения и соответствующие доверительные интервалы [Q1,Q3]): А – уровень матриксных металлопротеиназ 2, 3, 9 типа и ТИМП-1 и ТИМП-2 у условно здоровых мужчин; Б – уровень матриксных металлопротеиназ 1 и 7 типа

• Figure 1.    Indicators of the metalloproteinase system and their tissue inhibitors in conditionally healthy men of different ages (median values and corresponding confidence intervals [Q1,Q3]): A – levels of matrix metalloproteinases type 2, 3, 9 and TIMP-1 and TIMP-2 in conditionally healthy men; Б – levels of matrix metalloproteinases type 1 and 7

Таблица 1. Статистическая достоверность различий показателей системы металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов у условно здоровых мужчин разных возрастных групп

Table 1. Statistical significance of differences in indicators of the metalloproteinase system and their tissue inhibitors in conditionally healthy men of different age groups

Показатель, нг/мл	Практически здоровые мужчины, n = 151 чел.
	Молодой возраст, n = 30 чел.	Средний возраст, n = 41 чел.	Пожилой возраст, n = 62 чел.	Старческий возраст, n = 18 чел.
	1	2	3	4
ММП-1	р 1-2 > 0,05	р 2-3 > 0,05	р 1-3 > 0,05 р 3-4 = 0,035	р 1-4 = 0,03 р 2-4 = 0,04
ММП-2	р 1-2 > 0,05	р 2-3 > 0,05	р 1-3 = 0,05 р 3-4 > 0,05	р 1-4 > 0,05 р 2-4 > 0,05
ММП-3	р 1-2 > 0,05	р 2-3 > 0,05	р 1-3 > 0,05 р 3-4 > 0,05	р 1-4 > 0,05 р 2-4 > 0,05
ММП-7	р 1-2 > 0,05	р 2-3 > 0,05	р 1-3 > 0,05 р 3-4 = 0,036	р 1-4 = 0,035 р 2-4 = 0,038
ММП-9	р 1-2 > 0,05	р 2-3 = 0,038	р 1-3 = 0,032 р 3-4 > 0,05	р 1-4 = 0,028 р 2-4 = 0,034
ТИМП-1	р 1-2 < 0,0001	р 2-3 = 0,038	р 1-3 > 0,05 р 3-4 = 0,05	р 1-4 = 0,045 р 2-4 < 0,0001
ТИМП-2	р 1-2 > 0,05	р 2-3 > 0,05	р 1-3 > 0,05 р 3-4 > 0,05	р 1-4 > 0,05 р 2-4 > 0,05
ММП-9/ТИМП-1, пг/мл	р 1-2 > 0,05	р 2-3 > 0,05	р 1-3 > 0,05 р 3-4 > 0,05	р 1-4 > 0,05 р 2-4 > 0,05
ММП-9/ТИМП-2, пг/мл	р 1-2 = 0,045	р 2-3 < 0,0001	р 1-3 > 0,05 р 3-4 = 0,001	р 1-4 = 0,0001 р 2-4 = 0,002

Примечание. Достоверность различий по возрасту определяется при p-value ≤ 0,05.

Проводя анализ результатов средней возрастной группы мужчин с ФР, были отмечены более высокие значения ММП-3, уровни комплексов ММП-9/ТИМП-2, а ТИМП-1 был выше в 4,4 раза (р 3-4 = 0,0001). В то время как у исследуемых без ФР в данной группе отмечались более высокие показатели ММП-1, ММП-2 (р 3-4 = 0,036), ММП-9 (р 3-4 = 0,031), а также ТИМП-2.

В группе пожилого возраста ФР способствовали более высоким значениям сразу нескольких показателей: ММП-2 (р 5-6 = 0,04), ММП-3 (р 5-6 = 0,038) и ТИМП-1 (р 5-6 = 0,0012) (табл. 2).

Необходимо отметить, что наличие ФР в группе старческого возраста способствовало более высоким значениям ММП-3 (р = 0,01). Аналогичная закономерность наблюдалась по показателям ММП-9

(р 7-8 = 0,04), ТИМП-1 (р 7-8 = 0,034) и комплексов ММП-9/ТИМП-2, которые также были выше в этой части группы, в то время, как уровень ММП-1 был ниже (р 7-8 = 0,049) (табл. 2).

Особое внимание заслуживает проведённый анализ системы металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в зависимости от влияния одного из факторов риска – курения. В молодом возрасте курение приводило к повышению ММП-2 (113,1 (92,1;134,2) нг/мг против 93,4 (70,4;85,1) нг/мг, р = 0,03), ММП-7 (2,2 (2,12;3,2) против 1,7 (1,11;1,76), р = 0,05), также отмечены самые высокие показатели комплексов ММП-9/ТИМП-2 (199,7 (169,0;1836,0) пг/мл против 137,4 (111,4;144,3) пг/мл, р = 0,023). В группе мужчин среднего возраста курение способствовало высоким показателям ММП-3 (27,9 (27,6;28,3) нг/мл против 25,6 (6,5;27,6) нг/мл, р = 0,04), ТИМП-1 (233,4 (121,3; 245,7) нг/мг против 175,8 (132,4; 176,3) нг/мг, р = 0,04) и ММП-9/ТИМП-2 (187,6 (120,5;254,6) пг/мг против 137,4 (111,4;144,3) пг/мг, р = 0,03). В группе пожилых мужчин установлено, что курение статистически достоверно способствовало повышению ММП-1 (0,63 (0,61;0,82) нг/мл против 0,52 (0,47;0,62) нг/мл, р1-3 = 0,042), ММП-2 (122,0 (115,3;169,9) нг/мл против 93,4 (70,4;85,1) нг/мл, р2-3 = 0,01), ММП-9 (61,6 (57,3;154,4) нг/мл против 53,1 (42,9;80,5) нг/мл, р = 0,048), ТИМП-1 (253,6 (90,1;325,5) нг/мл против 148,2 (102,1; 197,6) нг/мл, р = 0,023) и комплексов ММП-9/ТИМП-2 (167,1 (102,4;175,4) пг/мл против

123,6 (28,7;1046,8) пг/мл, р = 0,04). В старческом возрасте курение приводило к повышению уровня ММП-1 (0,62 (0,6;0,69) нг/мл против 0,52 (0,47;0,62) нг/мл, р = 0,05), ММП-2 (128,2 (121,3;141,2) нг/мл против 93,4 (70,4;85,1) нг/мл, р = 0,01), ММП-3 (31,3 (27,09;43,1) нг/мл против 22,4 (14,3;26,3) нг/мл, р = 0,04), ММП-9 (87,2 (86,1;90,12) нг/мл против 53,1 (42,9;80,5) нг/мл, р = 0,049).

Нами были зафиксированы закономерные изменения индекса активности ММП-3 по отношению к ТИМП-1 и ТИМП-2 (рис. 2). Так, факторы риска способствуют активации ММП-3, а самые высокие значения у индекса ММП-3/ТИМП-1 были отмечены у мужчин старческого возраста с ФР.

Таблица 2. Показатели системы металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов у условно здоровых мужчин разных возрастных групп с учётом наличия/отсутствия факторов риска (медианные значения и соответствующие доверительные интервалы [Q1, Q3])

Table 2. Indicators of the metalloproteinase system and their tissue inhibitors in conditionally healthy men of different age groups, taking into account the presence/absence of risk factors (median values and corresponding confidence intervals [Q1, Q3])

Показатель, нг/мл	Практически здоровые мужчины молодого возраста, n = 30 чел.		Практически здоровые мужчины среднего возраста, n = 41 чел.		Практически здоровые мужчины пожилого возраста, n = 62 чел.		Практически здоровые мужчины старческого возраста, n = 18 чел.
	без ФР n = 14 чел	с ФР, n = 16 чел.	без ФР n = 18 чел.	с ФР, n = 23 чел.	без ФР, n = 27 чел.	с ФР, n = 35 чел.	без ФР, n = 9 чел.	с ФР, n = 9 чел.
	1	2	3	4	5	6	7	8
ММП-1	0,75 (0,64; 0,87) р 1-2 = 0,044	0,52 (0,47; 0,62)	0,64 (0,6; 0,68) р 3-4 = 0,045	0,45 (0,41; 0,62)	0,67 (0,63; 0,72) р 5-6 > 0,05	0,69 (0,65; 0,82)	0,72 (0,71; 0,78) р 7-8 = 0,049	0,65 (0,64; 0,69)
ММП-2	120,1 (110,5; 140,1) р 1-2 > 0,05	113,1 (92,1; 134,2)	126,1 (107,4; 141,3) р 3-4 = 0,036	78,4 (70,4; 85,1)	122,3 (63,0; 151,8) р 5-6 = 0,04	167,0 (125,3; 169,9)	135,2 (122,2; 160,9) р 7-8 > 0,05	128,2 (121,3; 131,2)
ММП-3	21,7 (18,8; 25,5) р 1-2 = 0,048	24,4 (19,3; 36,3)	19,1 (4,7; 24,7) р 3-4 = 0,042	27,9 (27,6; 38,3)	17,3 (9,5; 25,1) р 5-6 = 0,038	27,4 (10,6; 34,7)	20,6 (14,4; 22,8) р 7-8 = 0,01	37,3 (31,09; 43,1)
ММП-7	1,6 (1,4; 2,3) р 1-2 = 0,039	2,5 (2,3; 3,2)	2,1 (0,8; 2,5) р 3-4 > 0,05	2,4 (1,8; 3,1)	2,4 (1,8; 2,8) р 5-6 > 0,05	2,5 (1,9; 2,9)	1,4 (0,3; 2,1) р 7-8 > 0,05	1,4 (1,11; 1,76)
ММП-9	129,5 (57,5; 151,7) р 1-2 = 0,0023	53,1 (42,9; 80,5)	91,5 (58,5; 129,1) р 3-4 = 0,031	34,6 (26,8; 45,7)	52,4 (40,1; 137,7) р5-6 = 0,049	71,6 (57,3; 154,4)	57,1 (51,5; 84,4) р 7-8 = 0,04	97,2 (86,1; 101,12)
ТИМП-1	103,7 (25,8; 192,1) р 1-4 = 0,023	148,2 (102,1; 197,6)	52,0 (22,2; 225,2) р 3-4 < 0,0001	233,4 (121,3; 245,7)	112,9 (28,5; 180,2) р 5-6 = 0,0012	253,6 (90,1; 325,5)	115,4 (46,7; 201,1) р 7-8 = 0,034	165,8 (132,4; 176,3)
ТИМП-2	46,4 (42,9; 48,6) р 1-2 > 0,05	54,2 (46,7; 56,0)	48,3 (46,3; 50,9) р 3-4 > 0,05	44,0 (41,2; 48,9)	53,1 (50,2; 54,5) р 5-6 > 0,05	53,3 (51,3; 62,5)	48,7 (44,9; 54,9) р 7-8 > 0,05	40,2 (23,6; 43,2)
ММП-9/ТИМП-1, пг/мл	3,2 (2,9; 3,8) р 1-2 = 0,045	3,9 (3,8; 4,3)	3,5 (2,1; 3,9) р 3-4 > 0,05	4,3 (3,7; 5,0)	3,7 (2,9; 4,4) р 5-6 > 0,05	3,8 (3,3; 4,2)	3,7 (2,7; 4,0) р 7-8 > 0,05	3,6 (3,21; 3,8)
ММП-9/ТИМП-2, пг/мл	146,9 (138,9; 175,1) р 1-2 = 0,0012	238,7 (169,0; 1836,0)	110,0 (78,3; 148,6) р 3-4 = 0,045	187,6 (120,5; 254,6)	143,8 (76,2; 240,9) р 5-6 > 0,05	157,1 (102,4; 175,4)	44,3 (13,1; 976,3) р 7-8 = 0,024	117,4 (111,4; 134,3)

Примечание. Достоверность различий без/с ФР определяется при p-value ≤ 0,05.

ММП-3/ТИМП-1    ММП-3/ТИМП-2

М, молодой

М, старческий возраст,без ФР

возраст, с ФР

0,8

0,6

М, старческий возраст, с ФР

М, молодой возраст, без ФР

М, средний возраст, с ФР

М, пожилой возраст,без ФР

М, средний возраст,без ФР

М, пожилой возраст, с ФР

Рисунок 2. Индекс ингибирования ММП-3 у мужчин разного возраста

• Figure 2.    MMP-3 inhibition index in men of different ages

Обсуждение

Старение тесно связано с изменениями сердечнососудистой системы. Изменение внеклеточного матрикса (ВКМ) является одним из основных процессов в патологическом старении [8]. Матриксные металлопротеиназы — это группа чрезвычайно активных ферментов, регулирующих связанные с возрастом структурные изменения сосудистой сети, которые считаются отличительной чертой старения артерий [12]. Так, например, ММП-1 может отвечать за ангиогенный потенциал путём регулирования миграции эндотелиальных клеток. ММП-2 увеличивает жёсткость сосудистой стенки, что подтверждено в нашем исследовании практически во всех группах с ФР. Мат-риксная металлопротеиназа-3 (стромелизин-1) может способствовать центральной артериальной жёсткости посредством её участия в гомеостазе и ремоделировании ВКМ [13]. В нашем исследовании курение и другие факторы риска сосудистых заболеваний подтверждали более высокие значения ММП-3. ММП-9 является одной из самых сложных форм мат-риксных металлопротеиназ. ММП-9 обладает способностью разрушать компоненты внеклеточного матрикса и играет важную роль в патофизиологических функциях [14]. В нашем исследовании ММП-9

показал неоднозначные колебания в разных возрастных группах.

Заключение

Проведённое исследование выявило определённую корреляцию между факторами риска и уровнями матриксных металлопротеиназ у условно здоровых мужчин в разных возрастных группах. Установлены разнонаправленные изменения ММП и ТИМП. Анализируя наиболее значимые показатели, задокументировано, что уровни ММП-9 и ММП-9/ ТИМП-2 с возрастом снижаются, однако наличие факторов риска и, в большей степени, курение повышает эти показатели в пожилом и старческом возрасте. Значения ТИМП-1 имеют волнообразную изменчивость с возрастом, однако факторы риска и курение неизменно повышают его показатели во всех возрастных группах. Наиболее яркое влияние курения на ММП-9 выявлено в молодом и среднем возрасте, а на ТИМП-1 – в среднем и пожилом. Выявленные изменения подчёркивают физиологические возрастные характеристики, способные приводить к выраженным гемодинамическим и метаболическим изменениям.