Исследование устойчивости митохондрий миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению сердца у крыс, адаптированных к хронической гипоксии

Внутригоспитальная летальность от острого инфаркта миокарда (ОИМ) в НИИ кардиологии составляет 13,8% [3], а в европейских странах достигает 7% [10]. Такой высокий показатель летальности во многом объясняется отсутствием патогенетически обоснованных методов повышения толерантности сердца к действию ишемии-реперфузии. Определенные перспективы в этом направлении может иметь адаптация организма к гипоксии, стрессу, холоду и другим экстремальным воздействиям [13]. Однако механизмы формирования повышенной устойчивости сердца при адаптации к хронической гипоксии остаются недостаточно изученными. Согласно общепринятому мнению, ключевым звеном гипоксической адаптации является перестройка энергетического метаболизма [2]. Вместе с тем взаимосвязь функционального состояния митохондрий с механизмами инициации клеточной гибели или, напротив, повышения резистентности кардиомиоцитов к гипоксии-реоксигенации остается неясной. Известно, что индукция апоптоза и некроза кардиомиоцитов во многом определяется состоянием митохондриальных пор переменной проницаемости (МРТ-пор, mitochondrial permeability transition pore).

Цель: оценить влияние адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии на функциональное состояние митохондрий при моделировании глобальной ишемии и реперфузии миокарда.

Задачи:

• 1)    изучить влияние адаптации хронической непрерывной нормобарической гипоксии на показатели дыхания миокардиальных митохондрий после ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс;

• 2)    оценить трансмембранный потенциал митохондрий, изолированных из миокарда крыс, адаптированных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии;

• 3)    исследовать устойчивость МРТ-пор митохондрий к ионам кальция после ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на крысах-самцах Вистар массой 250–300 г. В контрольной группе изолированные сердца животных подвергали нормотермической перфузии на протяжении 95 мин без моделирования ишемии. Сердца крыс 2-й группы подвергали воздействию глобальной ишемии (45 мин)-реперфузии (30 мин). Животных 3-й группы перед изоляцией сердца и моделированием ишемии-реперфузии адаптировали к хронической непрерывной нормобарической гипоксии при 12% О2, 0,03% СО2 и нормальном атмосферном давлении на протяжении 21 суток [11]. Давление О2 и СО2 внутри гипоксической камеры постоянно поддерживали системой “Био-нова-204G4R1” (НТО “Био-нова”). У крыс, наркотизированных диэтиловым эфиром, извлекали сердца и помещали в охлажденный до 4 °С раствор Кребса–Хензелай-та. Аорту канюлировали и осуществляли ретроградную перфузию по методу Лангендорфа буфером Кребса–Хен-зелайта. Ишемию моделировали с помощью полного прекращения подачи буферного раствора на 45 мин с последующей 30-минутной реперфузией.

Митохондрии выделяли из миокарда желудочков методом дифференциального центрифугирования [4, 6]. Для этого желудочки сердца измельчали ножницами при 2 °С, а затем гомогенизировали (стекло-стекло) в растворе, содержащем (в мМ): 70 сахароза, 210 маннитол, 1 EGTA, 10 Hepes, 5 мг/мл БСА, рН 7,4. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 900 g в рефрижераторной центрифуге “Eppendorf 5810 R” (“Eppendorf AG”). Супернатант отбирали, а митохондрии, содержавшиеся в нем, осаждали центрифугированием при 9000 g в течение 10 мин. Осадок, содержавший митохондрии, промывали буфером (70 мМ сахарозы, 210 мМ маннитола, 0,1 мМ EGTA, 10 мМ Hepes, рН 7,4) и осаждали повторным 10-минутным центрифугированием при 9000 g. Содержание белка в суспензии митохондрий определяли по методу Брэдфорд [5].

Измерение трансмембранного потенциала митохондрий (Дш) проводили с использованием катионного флю- оресцентного зонда – этилового эфира тетраметилро-дамина (TMRE, tetramethylrhodamine ethyl ester) – на спек-трофлюориметре “Shimadzu RF-5301-PC” при длинах волн возбуждения/излучения 550 и 575 нм [12] в буфере, содержавшем 200 мМ сахарозы, 10 мМ трис-HCl, 1 мМ КН2РО4, 10 мкМ EGTA, 0,3 мМ пирувата, 0,3 мМ малата, рН 7,4 при 25 °С. Конечная концентрация TMRE составляла 150 нмоль/л, содержание митохондрий – 1 мг/мл [14]. “Сброс” Дш осуществляли добавлением разобщителя FCCP – Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone – в конечной концентрации 0,1 мкМ. За величину трансмембранного потенциала принимали падение флюоресценции при добавлении FCCP.

Состояние МРТ-поры оценивали по Са2+-связывающей способности митохондрий, которую определяли с помощью флюоресцентного Са2+-чувствительного зонда Calcium Green-5N (“Invitrogen, Molecular Probes Inc.”) при длинах волн возбуждения/излучения 506 и 532 нм [4, 8, 14] на спектрофлюориметре “Shimadzu RF-5301-PC”. Среда инкубации содержала (в мМ): 200 сахароза, 10 трис-HCl, 1 КН2РО4, 0,01 М EGTA, 0,3 пирувата, 0,3 малата, рН 7,4 (25 °С, объем 3 мл), при концентрации Calcium Green-5N 100 нМ и митохондрий 1 мг/мл. К суспензии митохондрий дробно добавляли по 100 нМ CaCl2. Са2+-связы-вающую способность митохондрий вычисляли по максимальному количеству аккумулированного митохондриями Са2+ в пересчете на 1 мг митохондриального белка [8].

Оценку параметров дыхания митохондрий проводили по уровню поглощения ими кислорода. Среда инкубации митохондрий имела следующий состав: 180 мМ сахарозы, 70 мМ маннитола, 5 мМ КН2РО4, 5 мМ MgCl2, 10 мМ Hepes, рН 7,37 [14]. Скорость поглощения кислорода измеряли в присутствии НАДН-зависимых субстратов – 3 мМ малата и 3 мМ пирувата (состояние 2, V2) – и после добавления 200 нМ АДФ (состояние 3, V3), а также в момент завершения синтеза АТФ (состояние 4, V4). Эффективность дыхания вычисляли по соотношению количественных величин добавленного АДФ и поглощенного в течение состояния 3 кислорода (коэффициент АДФ/О).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. Рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (SEM). Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение

В группе неадаптированных крыс, сердце которых было подвергнуто 45-минутной ишемии и 30-минутной реперфузии, наблюдалось статистически достоверное снижение абсолютной скорости НАДН-зависимого дыхания в состоянии 3 (V3) по сравнению с показателем у интактных животных (таблица). Наряду с этим в указанной группе было зарегистрировано достоверное снижение коэффициента АДФ/О, что говорит о разобщении процессов окисления и фосфорилирования. При этом величина трансмембранного потенциала (Дш) митохондрий, выделенных после окончания ишемии-реперфузии, оказалась на 20% ниже, чем в сердцах интактных крыс

Таблица Параметры дыхания, трансмембранный потенциал (Д ш) и Ca2 + –связывающая способность (КСС) митохондрий при ишемии-реперфузии и адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии (M±SEM)
Параметры дыхания	Контроль (n=16)	Ишемия-реперфузия (n=11)	Адаптация к гипоксии + ишемия-реперфузия (n=10)
V2, нМ [О2]/мг белка/мин (НАДН-зависимое дыхание)	32,34±2,18	28,59±5,76	25,77±4,84
V3, нМ [О2]/мг белка/мин (НАДН-зависимое дыхание)	121,98±12,98	93,96±13,19*	121,67±27,88+
V4, нМ [О2]/мг белка/мин (НАДН-зависимое дыхание)	41,06±2,86	36,18±7,89	50,66±14,77
АДФ/О, нМ АДФ/нМ атом[O] (НАДН-зависимое дыхание)	2,4±0,52	1,76±0,21*	2,10±0,19+
Д ш, U/мг белка	14,22±1,2	11,25±1,8*	13,85±1,1+
КСС, нМ [Ca2+]/ мг белка	283,5±21	227,0±16*	250,0±17+

Примечание: р<0,05 по отношению * – к контролю: + – к ишемии-реперфузии.

(таблица).

Нарушение продукции АТФ при ишемии и реперфузии является общеизвестным фактом. Так, после 40-минутной коронароокклюзии уровень АТФ снижается до 35% от нормы и остается на 22% ниже нормы после 40минутной реперфузии [1]. Уменьшение количества АТФ является следствием замедления скорости его синтеза. Так, после тотальной 30-минутной ишемии и последующей реперфузии (15 мин) изолированного перфузируемого сердца крысы дыхание митохондрий в состоянии 3, косвенно характеризующее скорость синтеза АТФ, падает на 31% [7]. Объяснить снижение скорости дыхания и продукции АТФ, наблюдаемое после окончания реперфузии, нехваткой кислорода или субстратов нельзя. Вполне очевидно, что в данном случае происходит нарушение синтеза АТФ в митохондриях.

Причиной замедления синтеза АТФ в условиях реперфузии может быть потеря цитохрома С. Цитохром С является одним из звеньев дыхательной цепи, поэтому его утечка из митохондрий в цитоплазму может привести к снижению скорости транспорта электронов и уменьшению скорости дыхания митохондрий. Так, обнаружено 3-кратное уменьшение количества цитохрома С в митохондриях, выделенных из реперфузируемого сердца [7]. Главным каналом выхода цитохрома С из митохондрий является открывающаяся в условиях патологии МРТ-пора [9]. МРТ-поры митохондрий миокарда кролика, подвергнутого коронароокклюзии-реперфузии in vivo , оказываются более чувствительными к нагрузке ионами Са₂⁺ [4]. Это может быть причиной их преждевременного открытия, утечки цитохрома С и, соответственно, снижения скорости дыхания митохондрий.

В наших экспериментах открытие МРТ-пор митохондрий миокарда, подвергнутого ишемии-реперфузии, происходило под влиянием меньшего количества Са2+, чем в группе интактных крыс (таблица). Иными словами, Са2+-связывающая способность митохондрий кардиомиоцитов после ишемии-реперфузии оказалась на 16% (р<0,05) ниже таковой в митохондриях интактных сердец.

Таким образом, ишемия-реперфузия сердца приводит к дисфункции митохондрий, которая характеризуется уменьшением коэффициента АДФ/О, снижением скорости дыхания в состоянии 3, падением Дш и снижением устойчивости МРТ-поры к нагрузке ионами Са2+.

В ходе дальнейшего исследования мы обнаружили, что изменение дыхания митохондрий, индуцированное ише- мией-реперфузией, практически не выявляется в миокарде крыс, предварительно адаптированных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии (таблица). После ишемии-реперфузии скорость дыхания в состоянии 3 (V3) у таких животных оказалась достоверно выше, чем у неадаптированных особей (таблица). Значение коэффициента АДФ/О у таких особей было выше, чем в сердцах неадаптированных крыс, подвергнутых воздействию ишемии-реперфузии на миокард (таблица). Кроме того, у адаптированных крыс после воздействия ишемии-реперфузии на сердце не претерпевала изменений и величина Дш (таблица).

Сохранение величины трансмембранного потенциала является следствием функциональной и структурной сохранности внутренней мембраны митохондрий адаптированных крыс, важнейшим условием которой является отсутствие неспецифической проницаемости митохондриальных мембран, т.е. поддержание МРТ-пор в закрытом состоянии [9]. Как показали наши исследования (таблица), величина Са2+-связывающей способности митохондрий крыс, подвергнутых предварительной адаптации, не снижалась при моделировании ишемии-реперфузии и оставалась достоверно неотличимой от этого показателя в группе контроля. Сохранение высокой Са2+-связывающей способности митохондрий после реперфузии сердец адаптированных животных как раз и свидетельствует об устойчивости МРТ-поры к открытию. Наши данные согласуются с результатами китайских физиологов [15], которые в экспериментах на крысах, адаптированных к периодической гипобарической гипоксии, также обнаружили, что адаптация приводит к увеличению устойчивости кардиальных митохондрий к нагрузке ионами Са2+.

Проведенные исследования показали, что воздействие ишемии и реперфузии на сердце приводит к снижению Са2+-связывающей способности митохондрий. Этот факт указывает на увеличение чувствительности МРТ-пор к ионам Са2+. Одновременно было зафиксировано снижение скорости дыхания митохондрий в состоянии 3 на НАДН-зависимых субстратах, а также разобщение окислительного фосфорилирования и уменьшение величины Дш. Адаптация животных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии в определенной мере способствует сохранению функционального состояния митохондрий после воздействия ишемии-реперфузии на изолированное перфузируемое сердце. Мы предполагаем, что повышение устойчивости митохондрий к воздействию гипоксии и реоксигенации на миокард может иметь прямое отношение к механизмам кардиопротек-тивного действия адаптации.

Выводы

• 1.    Адаптация крыс к хронической непрерывной нормобарической гипоксии повышает скорость дыхания миокардиальных митохондрий в состоянии 3, а также коэффициент АДФ/О после ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс.

• 2.    Трансмембранный потенциал митохондрий миокарда крыс, адаптированных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии, не снижается после моделирования глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца.

• 3.    Устойчивость МРТ-пор митохондрий к нагрузке ионами кальция сохраняется на высоком уровне после ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.