Исследование влияния экстрактов чабреца и цветков ромашки на каталитическую активность трипсина

Введение. Жизнедеятельность любого организма обеспечивается сложной совокупностью химических реакций, осуществляемых ферментативными системами органов и тканей, и любое изменение в их взаимодействии может повлечь серьезные последствия. Известно, что развитие патологических процессов в организме человека и животных сопровождается разбалансировкой регуляторных механизмов, в частности состояния ферментов - протеиназ и их регуляторов. Эндогенные регуляторы, ингибиторы и активаторы зачастую не справляются со своей задачей по поддержанию баланса в системе «фер- мент-субстрат-ингибитор (активатор)», что приводит к возникновению деструктивных воспалительных, иммунных реакций, нарушению гомеостаза [1-3].

Поэтому поиск пока еще неизвестных регуляторов протеаз не только позволяет получить новые знания о процессах регулирования метаболизма клетки, но и представляет собой важный шаг к созданию новых препаратов для лечения заболеваний, связанных с изменениями, происходящими в процессах протеолиза. В связи с этим нами предложена гипотеза о регуляторной роли лекарственных трав, широко используемых как в традици- онной, так и в народной медицине. По нашему предположению, химические соединения, содержащиеся в лекарственных травах, вероятно, могут как активировать, так и ингибировать процессы протеолиза. Высокий уровень активности протеолитических ферментов востребован на первых стадиях развития воспалительного процесса, а в дальнейшем, после нейтрализации источника воспалительного процесса, необходимо снижение активности протеолитических ферментов [4–6].

Одними из растений, влияющих на процессы протеолиза, являются чабрец и ромашка. Их лечебные свойства неоспоримы и признаны как официальной, так и народной медициной. Применение этих трав ввиду их терапевтической универсальности эффективно при терапии множества болезней и неблагоприятных состояний. Польза растений объясняется их богатым составом. Они нашли применение в комплексной терапии при инфекционно-воспалительных заболеваниях лор-органов и полости рта, а также ряда желудочно-кишечных заболеваний. В ряде лекарственных препаратов чабрец и ромашка выступают как основное действующее вещество. Также эти травы эффективны в виде отваров и настоев как успокоительные средства и антисептики, они улучшают переваривание тяжелой жирной пищи, ускоряя обмен веществ [7, 8].

Следует отметить, что вопросу взаимодействия компонентов лекарственных трав с протеолитическими ферментами в современной литературе уделено незначительное внимание. В то же время такого рода взаимодействие представляет интерес в рамках способности этих соединений регулировать, ингибировать или активировать активность ключевых энзимов [9].

Цель исследования. Изучение в модельных опытах воспалительного процесса, влияния регуляторной активности водных экстрактов чабреца и ромашки на активность протеолитического фермента трипсин.

Материалы и методы. В исследованиях использовали следующие препараты:

• 1.    «Трипсин кристаллический» с активностью 10000 ед./мг (ООО «Самсон-Мед», Россия, ЛС-000403).

• 2.    Чабрец, или тимьян ползучий (Thymus serpyllum herba) (ЗАО «Иван-Чай», Россия, ФС. 2.5.0047.15).

• 3.    Ромашки цветки (ООО ПКФ «Фито-фарм», Россия).

Водные экстракты готовили по технологии, предложенной производителями. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со штифтом вместимостью 250 мл, прибавляли 100 г дистиллированной воды и проводили экстракцию в течение 15 мин на водяной бане при температуре 95–99 °С, далее охлаждали в течение 45 мин при комнатной температуре, процеживали через ватно-марлевый фильтр, а оставшееся сырье отжимали. Объем экстракта доводили до 100 мл.

Определение активности трипсина проводили по методу, разработанному Ансоном. Метод основан на количественном определении тирозина и триптофана в продуктах расщепления казеина.

Кристаллический трипсин растворяли в физиологическом растворе (рН=8,0), к 0,5 мл полученного раствора трипсина прибавляли 0,1, 0,15 и 0,2 мл водного экстракта чабреца, пробы термостатировали при 38 °С в течение 10 мин. Далее в пробирки вносили субстрат. В качестве субстрата был использован 1 % раствор казеина (рН=8,0). Образец термостатировали при 38 °С в течение 30 мин. Реакцию протеолиза останавливали прибавлением 1 мл 10 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В качестве контроля использовали пробу, аналогичную опытной, но ТХУ вносили предварительно, до второго термостатирования [10].

Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Оптическую плотность раствора измеряли на приборе СФ-2000 в пробе против контроля в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 260 и 280 нм. Для вычисления концентрации в растворе гидролизованного протеина, маркером которого является тирозин, в продуктах гидролиза казеина использовали формулу Калькара:

А=1,45Е280 0,67Е260, где А – концентрация гидролизованного протеина, мг/мл; Е – оптическая плотность при длине волны 260 и 280 нм.

Далее исходя из показателей оптической плотности растворов рассчитывали активность трипсина.

Регуляторную активность экстрактов чабреца и цветков ромашки оценивали по соотношению активности трипсина в опытной пробе и с различным количеством экстрак- тов, по степени изменения активности трипсина.

Результаты и обсуждение. В проведенных исследованиях нами были созданы градиенты концентраций водных экстрактов чабреца и цветков ромашки, приготовленных по рекомендуемым технологиям, которые, по нашему предположению, позволяют оценить величину регуляторной активности исследуемых экстрактов (табл. 1).

Таблица 1

Показатели активности трипсина в присутствии водного экстракта чабреца

Состав инкубационной среды	Опытные группы
	1	2	3	4
Количество экстракта чабреца, мл	0	0,1	0,15	0,2
Количество чабреца, мг	0	0,93	1,39	1,86
Соотношение «трипсин : чабрец»	1:0	1:0,75	1:1,11	1:1,48
Активность трипсина, нмоль/(мл∙мин)	0,594±0,250	1,142±0,078	1,516±0,174	1,892±0,215

Как свидетельствуют полученные результаты исследований, водный экстракт чабреца модулирует значительное увеличение активности трипсина в данном диапазоне концентраций. Увеличение количества водного экстракта чабреца в инкубационной среде практически линейно коррелирует с активностью трипсина, коэффициент корреляции R составляет 0,99.

Был проведен регрессионный анализ влияния экстрактов изучаемых лекарственных трав на каталитическую активность трипсина. В качестве зависимой переменной (У1 и У2) была выбрана гидролитическая активность трипсина, а независимыми пере- менными были в первом исследовании (Х1) количество водного экстракта чабреца, во втором (Х2) количество водного экстракта цветков ромашки. Уравнение регрессии взаимодействия переменных в первом исследовании имеет следующий вид:

У1=0,55+6,459X1, где У1 – активность фермента, нмоль/(мл∙мин белка); Х1 – количество водного экстракта чабреца, мл.

Положительные значения коэффициента корреляции переменных и коэффициента уравнения регрессии свидетельствуют о прямой взаимосвязи изучаемых переменных.

Таблица 2

Показатели активности трипсина в присутствии экстракта цветков ромашки

Состав инкубационной среды	Опытные группы
	1	2	3	4
Количество экстракта цветков ромашки, мл	0	0,1	0,15	0,2
Количество цветков ромашки, мг	0	0,93	1,39	1,86
Соотношение «трипсин : цветки ромашки», мг	1:0	1:0,75	1:1,11	1:1,48
Активность трипсина, нмоль/(мл∙мин)	0,595±0,030	0,919±0,053	1,112±0,031	1,291±0,073

Как видно из табл. 2, прибавление экстракта цветков ромашки также увеличивает активность трипсина, причем это влияние имеет линейную зависимость, коэффициент корреляции составляет 0,99, но уравнение регрессионной зависимости имеет другие коэффициенты:

У2=0,58+3,485X2, где У2 – активность фермента, нмоль/(мл∙мин белка); Х2 – количество водного экстракта ромашки, мл.

Положительные значения коэффициента корреляции переменных и коэффициента уравнения регрессии также свидетельствуют о прямой взаимосвязи изучаемых переменных.

В ходе проведения экспериментов проведен сравнительный анализ влияния регуляторной активности отваров чабреца и цветков ромашки на активность трипсина, результаты которого представлены на рис. 1.

Как видно из рисунка, экстракт чабреца оказывает более эффективное влияние на гидролитическую активность трипсина по сравнению с экстрактом ромашки при условии равного количества в инкубационной среде. Таким образом, экспериментальные исследования продемонстрировали возможность применения экстрактов лекарственных трав чабреца и цветков ромашки для воздействия на активность протеолитических ферментов, в частности трипсина.

Рис. 1. Сравнительный анализ активности трипсина

Заключение. Результаты проведенных модельных исследований позволяют сформулировать некоторые выводы:

– экстракты чабреца и цветков ромашки оказывают активирующее действие на протеолитический фермент трипсин;

– уровень активации трипсина пропорционален количеству экстрактов, вносимому в инкубационную среду;

– экстракт чабреца оказывает более выраженное влияние на активность трипсина.

Полученные новые сведения о влиянии водных отваров лекарственных трав чабреца и цветков ромашки на гидролитическую активность трипсина позволят повысить эффективность использования лекарственных растений в практике лечения ряда патологических процессов.