Исследование влияния наночастиц нитрида гафния на эффективность сочетанного облучения нейтронами и протонами нормальных и опухолевых клеток in vitro

В последние годы для лечения онкологических больных всё чаще применяются высокотехнологичные методы лучевой терапии, в частности, с использованием протонных пучков [1, 2]. Актуальным направлением повышения эффективности и безопасности лучевого лечения становится поиск различных средств модификации радиобиологического эффекта облучения. Особенно это обосновано при протонной терапии, которая может быть недостаточно эффективной в случае радиорезистентных опухолей, поскольку протоны с энергией >25 МэВ характеризуются низкими величинами линейной передачи энергии (ЛПЭ) и принятой клинической величиной

Корякина Е.В.* - ст. науч. сотр., к.б.н.; Трошина М.В. - науч. сотр., науч. сотр. РУДН; Пичкунова А.А. - инженер; Потетня В.И. - ст. науч. сотр., к.б.н.; Сабуров В.О. – науч. сотр., и.о. зав. лаб.; Литун Е.В. – инженер; Голованова О.Ю. – инженер-физик; Лычагин А.А. – вед. науч. сотр., к.ф.-м.н.; Соловьев А.Н. – зав. лаб., к.ф.-м.н.; Корякин С.Н. – зав. отд., к.б.н.; Иванов С.А. – директор, чл.-корр. РАН, д.м.н., проф. каф. РУДН. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Каприн А.Д. – ген. директор, директор МНИОИ им. П.А. Герцена, зав. каф. РУДН, акад. РАН, д.м.н., проф. ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Завестовская И.Н. – зав. отд., д.ф.-м.н. НИЦ «Курчатовский институт», Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН.

относительной биологической эффективности (ОБЭ), равной 1,1. Известно, что большинство современных радиосенсибилизаторов были разработаны с целью усиления повреждающего действия на опухоль фотонных ионизирующих излучений. При этом их влияние на экспрессию генов, механизмы индукции и репарации повреждений ДНК, клеточную гибель, иммунный ответ могут отличаться от таковых для протонного излучения [3, 4]. Указанные обстоятельства определяют необходимость разработки новых способов повышения эффективности терапии протонами как в схемах сочетанного облучения с плотноионизирующими излучениями (нейтроны, ионы углерода) [5-7], так и в комбинации с радиосенсибилизаторами, эффективными при фотонном облучении.

К перспективным способам радиосенсибилизации в конвенциональной лучевой терапии, а в последнее время и в протонной, относится применение соединений металлов с высоким атомным числом (Z>52), таких как золото, платина, висмут, гафний в виде наночастиц (НЧ), благодаря соответствию их размеров (<100 нм) размерам биологически важных макромолекул, что позволяет им накапливаться внутри клеток. Одним из возможных механизмов усиления действия излучения НЧ считается генерация большего количества активных форм кислорода, повреждающих клеточные структуры вследствие образования вторичных электронов при взаимодействии излучения и НЧ [8].

В противоопухолевой терапии основными преимуществами использования наноматериалов в качестве носителя являются возможность адресной доставки препаратов к опухоли, визуализация опухоли, способность удерживать молекулы лекарственного средства, а также преодолевать проблемы растворимости, стабильности и резистентности [9]. Однако биораспределение НЧ всё ещё несовершенно из-за сложной динамики взаимодействий в биологических жидкостях, в результате которых могут измениться их биологическая идентичность и первоначальные функции [10], вызывающие комплексные реакции организма на наноматериалы и затрудняющие воздействие на определённые органы. Установлено, что определяющим фактором биораспределения НЧ является химический состав их поверхности, который играет важную роль как в их коллоидной стабильности, так и во взаимодействии с клеточными мембранами и другими биологическими объектами [11]. Несмотря на то, что химический состав поверхности НЧ можно изменить в течение или после их синтеза, уже хорошо известно, что присутствующие в биологических жидкостях белки и другие биомолекулы потенциально могут адсорбироваться на поверхности НЧ, образуя оболочку, «белковую корону», влияющую на их общий фармакологический и токсикологический профиль [11].

Из перспективных радиосенсибилизаторов на основе НЧ тяжёлых металлов обращает на себя внимание гафний. Так, в 2013 г. был разработан препарат NBTXR3 (Nanobiotix, Франция) с НЧ гафния в форме оксида (HfO 2 ), который обладал меньшей токсичностью среди аналогичных материалов [12, 13]. Отечественные учёные отметили перспективность использования другого соединения гафния – нитрида гафния (HfN), благодаря его уникальным плазмонным свойствам, что позволяет рассматривать его не просто как радиосенсибилизатор в протонной терапии, но и как агент для фототермической терапии и мультимодальной визуализации [14, 15].

Кроме уже традиционного рассмотрения НЧ тяжёлых металлов в качестве радиосенсибилизаторов в гамма-терапии перспективно их изучение с точки зрения усиления действия протонной терапии. Учитывая, что в нашем исследовании применяются наряду с протонами быстрые нейтроны, важно отметить у изотопов гафния возможность протекания ядерной реакции (n, α)

с образованием α-частиц с высокой ЛПЭ, что может в большей степени увеличить повреждающий эффект в опухолевых клетках.

Цель работы состояла в исследовании цитотоксического действия наночастиц нитрида гафния, а также влияния предварительной инкубации с ними нормальных и опухолевых клеток китайского хомячка на эффективность сочетанного облучения быстрыми нейтронами и протонами.

Материалы и методы

Исследования выполнены на нормальных (V-79) и опухолевых (В14-150) фибробластоподобных клетках китайского хомячка в логарифмической стадии роста культуры (24 ч после посева на свежую питательную среду).

Наночастицы нитрида гафния (НЧ HfN), синтезированные методом лазерной абляции в ацетонитриле (НИЯУ «МИФИ», Москва) и покрытые силан-полиэтиленгликолем (ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва), представляли собой достаточно густой коллоидный раствор тёмного цвета. Для каждой клеточной линии к опыту готовили 8 флаконов: 4 без НЧ и 4 с НЧ. Раствор НЧ HfN добавляли непосредственно в ростовую среду, объём добавляемого раствора рассчитывали, исходя из конечной концентрации НЧ в 3 мл общего объёма. Время инкубации (37 °С, 5% СО 2 ) в присутствии НЧ HfN составляло 16-18 ч. После инкубации среду с НЧ HfN удаляли, монослой промывали несколько раз раствором Хенкса.

Цитотоксическое действие НЧ HfN на клетки обеих линий изучали при концентрациях 10, 25, 50, 100, 250, 500 мкг/мл с первой партией НЧ HfN, 100, 250 и 800 мкг/мл – со второй и 100, 250, 500 и 800 мкг/мл – с третьей партией. Характеристики используемых НЧ представлены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики наночастиц нитрида гафния, используемых в экспериментах in vitro

Характеристика	Номер партии наночастиц
	1	2	3
Состав	HfN, покрытие из силан-поли-этилен-гликоля-COOH (5 кДа), деионизованная вода	HfN, покрытие из силан-поли-этилен-гликоля-COOH (5 кДа), деионизованная вода	HfN, покрытие из силан-поли-этилен-гликоля-COOH (5 кДа), <0,1% сывороточного альбумина
Физическое или агрегатное состояние	Коллоид в жидкости	Коллоид в жидкости	(не указано)
Растворимость	Растворимы в воде	Растворимы в воде	(не указано)
Концентрация	6,75 мг/мл по Hf (ICP-MS) 7,28 мг/мл по HfN (расчётная)	2,5 мг/мл по Hf (ICP-MS) 2,7 мг/мл по HfN (расчётная)	17,5 мг/мл по Hf (ICP-MS) 19 мг/мл по HfN (расчётная)
Размер гидродинамический	140±90 нм в воде	140±90 нм в воде	75±35 нм в воде

Следует уточнить, что гидродинамические размеры НЧ, представленные в табл. 1, получены методом динамического рассеяния света (ДРС). Высокое значение стандартного отклонения гидродинамического диаметра указывает на полидисперсность и присутствие некоторой фракции агломератов или ассоциатов в растворе. Это типично для ДРС-анализа коллоидных систем. Вместе с тем, важно подчеркнуть, что метод ДРС измеряет гидродинамический диаметр, включающий сольватную оболочку и органическое покрытие, и чрезвычайно чувствителен к присутствию даже следовых количеств крупных агрегатов (поскольку интенсивность рассеяния пропорциональна радиусу частиц в шестой степени). Поэтому приведённое стандартное отклонение отражает флуктуации светорассеяния всей системы, а не истинный разброс физических размеров отдельных неорганических ядер HfN. Последний существенно у́же и по данным просвечива- ющей электронной микроскопии (ПЭМ) значение моды составляет 50 нм. Поскольку клетки взаимодействуют не с изолированным неорганическим ядром HfN, а со всей коллоидной единицей, включая органическое покрытие и возможные агломераты, то НЧ рассматривается как комплексная коллоидная система.

Непосредственно перед добавлением в питательную среду для инкубации клеток раствор НЧ HfN ресуспендировали в ультразвуковой ванне. Все эксперименты были проведены в течение 14 дней после получения суспензии НЧ HfN, её хранение до и между экспериментами осуществляли согласно описанию при +2/+8 °С.

Эффективность последующего облучения исследовали после предварительной инкубации клеток в присутствии 100 мкг/мл НЧ HfN (1-3 партии НЧ HfN), 250 мкг/мл (2, 3 партии НЧ HfN), 500 и 800 мкг/мл (3 партия НЧ HfN). Перед облучением флаконы полностью заполняли раствором Хенкса. Облучение нейтронами проводили в дозе 1 Гр на нейтронном генераторе НГ-14 (производитель ФГУП ВНИИ автоматики им. Н.Л. Духова, Москва), протонами – в дозе 5 Гр на комплексе протонной терапии «Прометеус» (производитель АО «ПРОТОМ», Протвино), расположенных в каньонах МРНЦ им. А.Ф. Цыба. Исследовали влияние НЧ HfN на эффективность схемы сочетанного облучения «нейтроны→протоны», для которой нами ранее был получен наибольший повреждающий эффект для опухолевых клеток: 1 Гр нейтронов (40% суммарной дозы с учётом ОБЭ нейтронов) → 1 ч → 5 Гр протонов (60% суммарной дозы с учётом ОБЭ протонов) [5]. Для установления эффекта комбинированного воздействия параллельно облучали клетки как с НЧ HfN, так и без них, отдельно нейтронами и протонами в тех же дозах, что и при сочетанном облучении.

До и после облучения клетки культивировали при 37 °С в присутствии 5% СО 2 в полной питательной среде DMEM (с добавлением 10-20% телячьей сыворотки, глютамина и антибиотиков). Оценку выживаемости проводили по клоногенной активности клеток (формирование колоний из одиночных клеток в течение 8-11 сут после воздействия). Более подробно особенности облучения и дозиметрического сопровождения на указанных источниках, методики культивирования, оценки выживаемости клеток и статистической обработки результатов описаны в работах [5-7]. Итоговые результаты представляли в виде средних значений доли выживших клеток (для всех повторных опытов) и их стандартных ошибок (M±SЕM). Значимость различий между схемами воздействия оценивали по Т-критерию Крамера-Уэлча [16] при уровне значимости 0,05, эффективность комбинированного воздействия – согласно классификации эффектов и по формулам, представленным в работе [17].

Результаты и обсуждение

Результаты исследования цитотоксических свойств НЧ HfN для нормальных (V-79) и опухолевых (В14-150) клеток китайского хомячка представлены на рис. 1. Сплошными линиями обозначены уровни выживаемости клеток в контроле, пунктирными – результирующие кривые изменения выживаемости в зависимости от концентрации НЧ HfN.

Видно, что несмотря на разброс экспериментальных значений выживаемости при каждой концентрации НЧ HfN из разных партий, отклонение их усреднённых значений от контрольного уровня (100% выживаемость) сопоставимо с их погрешностями (8-20%) для обеих клеточных культур, при этом различия не являются статистически значимыми (р>0,05). Таким образом, в исследованном диапазоне концентраций (10-800 мкг/мл) цитотоксического действия НЧ HfN на нормальные (V-79) и опухолевые (В14-150) клетки китайского хомячка установлено не было.

Рис. 1. Выживаемость клеток V-79 и В14-150 после инкубации в течение 16-18 ч в присутствии НЧ HfN в различных концентрациях (разными символами обозначены результаты разных опытов).

Следует отметить, что при исследовании цитотоксических свойств веществ, добавляемых непосредственно в культуральную среду клеток, параллельно с количественными измерениями проводили и качественную оценку состояния монослоя клеток. При добавлении раствора НЧ во флаконы с клетками наблюдали окрашивание ростовых сред и монослоёв клеток, интенсивность которого возрастала с увеличением концентрации НЧ HfN и сохранялась по окончании инкубации клеток с ними. Окрашивание монослоя клеток оставалось и после смены ростовой среды (перед облучением) на раствор Хенкса. При микроскопическом исследовании клеток установлено, что инкубация с НЧ HfN не приводила ни к морфологическим изменениям клеток, ни к нарушению их монослоя. Обращает на себя внимание, что распределение НЧ HfN по монослою клеток было неравномерным, что отражено на микрофотографиях на рис. 2.

100 мкг/мл HfN

800 мкг/мл HfN

Рис. 2. Фотографии монослоев клеток V-79 после инкубации в течение 16-18 ч в присутствии наночастиц нитрида гафния в разных концентрациях.

Далее, при подготовке суспензии клеток для последующего посева в чашки также отмечали окрашивание раствора трипсин-ЭДТА после первой обработки клеток. После центрифугирования (1000 об./мин в течение 3 мин) этого удалённого из флаконов с клетками раствора трипсин-ЭДТА наблюдали появление осадка, свидетельствующего о том, что НЧ HfN находились на мембранах клеток и после трипсинизации откреплялись и переходили в раствор.

Известно, что проникновение/накопление НЧ внутри клеток приводит к изменению реакции клеток в ответ на радиационное воздействие, в частности, к эффекту радиосенсибилизации [8, 12]. Результаты экспериментов по оценке влияния предварительной инкубации клеток китайского хомячка V-79 и В14-150 с НЧ HfN в разных концентрациях на эффективность нейтронного, протонного, а также сочетанного нейтронно-протонного облучения приведены на рис. 3 (данные повторных опытов объединены и представлены средние значения выживаемости).

Рис. 3. Выживаемость клеток V-79 и В14-150 после нейтронного, протонного и сочетанного нейтронно-протонного облучения с предварительной инкубацией с наночастицами нитрида гафния в разных концентрациях и без них.

Для обеих клеточных линий при облучении как отдельно нейтронами и протонами, так и при их сочетании никакой зависимости эффекта от предварительной инкубации клеток с НЧ HfN не выявлено. При этом результаты выживаемости клеток V-79 и В14-150 при облучении без предварительной обработки НЧ в настоящем исследовании хорошо согласуются с полученными ранее данными [5]. Статистических значимых различий для экспериментальных точек в отсутствии и в присутствии НЧ HfN в разных концентрациях не установлено (экспериментальные значения Т-критерия Крамера-Уэлча при соответствующем числе степеней свободы меньше критических). Наблюдаемый разброс экспериментальных точек обусловлен, скорее, отличающейся от опыта к опыту эффективностью посева клеток и малым количеством повторов. В целом, можно заключить, что предварительная инкубация клеток с раствором исследуемых НЧ HfN не оказывала влияния на эффективность лучевого воздействия.

Далее представляло интерес проверить, сохраняется ли эффект синергизма сочетанного нейтронно-протонного облучения [5] при добавлении третьего фактора – предварительной инкубации клеток с НЧ HfN. На рис. 4 представлены экспериментально установленные значения выживаемости при сочетанном нейтронно-протонном облучении после предварительной инкубации с НЧ HfN и без неё в сравнении с уровнями выживаемости, рассчитанными исходя из независимого действия трёх факторов [17].

При сравнении полученных результатов сочетанного облучения с независимым действием в отсутствии НЧ HfN эффект синергизма также воспроизводится для обеих культур. После предварительной инкубации в присутствии НЧ HfN для клеток V-79 синергизм сохраняется, а для клеток В14-150 эффект ближе к независимому действию, что, скорее, обусловлено разбросом экспериментальных значений выживаемости при их недостаточной статистической нагруженности.

Рис. 4. Выживаемость клеток V-79 и В14-150 после сочетанного нейтронно-протонного облучения в присутствии наночастиц нитрида гафния и без них в сравнении величинами, рассчитанными исходя из независимого действия факторов; * – различия значимы (р<0,05).

Представленные выше данные показывают, что в экспериментах не был выявлен дополнительный эффект, обусловленный ни радиационным повреждением клеток в результате применения НЧ HfN, как изначально предполагалось [8, 18], ни другими причинами. Что касается радиационного фактора, то его связывают, главным образом, с образованием Оже-электронов [8, 18-20]. На макроскопическом уровне его величина крайне мала, порядка 1% или менее, при облучении НЧ из другого металла с высоким Z – золота, протонами с энергией 1 и 10 МэВ, как показывают расчёты с использованием GEANT 4 версий 10.1 и выше [19]. Более заметно локальное увеличение дозы вокруг отдельно взятых НЧ из тяжёлых металлов (Ti, Zr, Hf, Ta, Au, Pt [8], Au [18], Au and Gd [20]), достигающее 1,16-2 раза и даже более [18]. Однако эта доза быстро спадает с увеличением расстояния от поверхности НЧ и эффективна на расстоянии нескольких нанометров [20]. Для сравнения, диаметр ДНК составляет 2 нм, а диаметр фибрилл с ДНК, основной структурной единицы хроматина, – 10 нм. Поэтому эффективное дополнительное радиационное воздействие НЧ на клетки при их облучении протонами возможно лишь в случае проникновения НЧ в ядро или хотя бы в цитоплазму клетки [18]. Облучение нейтронами с энергией 14,5 МэВ монослоя клеток с НЧ HfN также не приводило к изменению выживаемости клеток, указывая на незначительную величину дополнительного воздействия за счёт ядерных реакций с образованием плотноионизирую-щих α-частиц вследствие малой величины сечения этих реакций (единицы-десятки миллибарн).

Ещё одним фактором, объясняющим наблюдаемое отсутствие вклада НЧ HfN в повреждающее действие сочетанного облучения, может быть эффект биокороны (белковой короны, протеиновой короны), показанный в многочисленных работах с различными НЧ. Например, в работе [10] отмечается, что при введении НЧ в любую биологическую жидкость (кровь, культуральная среда и т.п.) на их поверхности неизбежно адсорбируются специфические биомолекулы, образуя биомолекулярную корону. На формирование такой белковой короны влияют как физические и химические свойства самих НЧ (тип, размер, форма, морфология поверхности, жёсткость, поверхностный заряд и т.д.), так и окружающие их условия (температура, рН, тип, состав, вязкость среды, время инкубации). Именно эти образования из НЧ и белков, а не сами НЧ, определяют дальнейшее взаимодействие с клетками (эндоцитарный путь и биологические реакции) [10]. Так, показано, что белковая корона значительно ингибирует поглощение фагоцитарными клетками НЧ золота, покрытых полиэтиленгликолем [21]. При этом более крупные НЧ (~70 нм) покрываются бóльшим количеством белков, чем частицы меньшего размера (~40 нм) [11]. Образующаяся белковая корона уменьшает контакт между клеточной мембраной и НЧ, снижая их адгезию [21].

В настоящем исследовании использовали НЧ с диаметром, превышающим оптимальный размер для проникновения внутрь клеток, 50 нм (при этом мода распределения составляла 50 нм), добавляли их в ростовую среду, содержащую сывороточные белки, к фибробластоподобным клеткам, не проявляющим фагоцитарных свойств. Возможно, в течение инкубации клеток в полной ростовой среде вокруг исследуемых НЧ HfN формировалась белковая корона, удерживающая НЧ на поверхности клеток за счёт образования пептидных связей с мембраной. Последующее воздействие трипсином-ЭДТА расщепляло эти связи и приводило к «переходу» НЧ HfN в раствор. С учётом изложенных выше факторов можно заключить, что НЧ HfN не проникали в клетки V-79 и В14-150, чем и обусловлено отсутствие эффекта от их применения.

Таким образом, представленные выше результаты проведённых исследований показывают, что предварительная инкубация нормальных и опухолевых клеток китайского хомячка с исследуемыми НЧ HfN не оказывает никакого дополнительного влияния на эффективность сочетанного облучения быстрыми нейтронами и протонами.

Заключение

В настоящей работе представлены результаты первых исследований возможности радиосенсибилизации сочетанного нейтронно-протонного облучения клеток китайского хомячка двух линий НЧ HfN. Предварительно было изучено цитотоксическое действие на клетки НЧ HfN двух размеров при нескольких концентрациях (до 800 мкг/мл). Различий в выживаемости клеток обеих линий после инкубации с НЧ и без неё установлено не было. Это позволило провести эксперименты по сочетанному облучению клеток в наиболее эффективной, по результатам предыдущих исследований, схеме воздействия (40% нейтронов и 60% протонов) в комбинации с НЧ HfN.

Исходя из литературных данных предполагалось, что дополнительный радиационный эффект от присутствия НЧ HfN в клетках будет обусловлен в основном протонным воздействием. Поэтому оценивали уровни выживаемости при выбранных дозах нейтронов и протонов как при их отдельном, так и при сочетанном применении. Полученные результаты подтвердили установленный ранее синергизм при нейтронно-протонном воздействии. Однако дополнительное усиление сочетанного действия или сенсибилизирующий эффект присутствия НЧ HfN не наблюдали ни при каком варианте облучения (нейтроны, протоны, нейтроны и протоны). Отсутствие радиосенсибилизирующего эффекта могло быть обусловлено тем, что используемые в работе НЧ HfN не проникали внутрь клеток, что подтверждалось изменениями окрашивания клеточного монослоя при манипуляциях с ним. Причинами могли быть большие размеры НЧ HfN (хотя по данным ПЭМ для этих частиц мода распределения физических размеров – 50 нм) и/или образование белковой короны, способствующей их прикреплению к поверхности клетки и препятствующей проникновению сквозь мембрану. Увеличение поглощённой дозы вблизи поверхности НЧ, весьма локальное, возможно, было недостаточным для воздействия на ядро клеток.

Следует отметить, что механизмы радиосенсибилизирующего действия НЧ в лучевой терапии остаются актуальной темой исследований. Устранение выявленных в работе ограничений и особенностей методики позволит реализовать установленный в других исследованиях радиосенсибилизирующий эффект НЧ HfN для протонного излучения. Кроме того, уникальные плазмонные свойства HfN, возможно, позволят использовать его и как агент для фототермичес-кой терапии.

Исследования проведены при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках Соглашения № 075-15-2025-453 от 30.05.2025 г.