Исследование влияния оксопроизводных азотсодержащих гетероциклических соединений на микробиом кишечника крыс

Поиск более безопасных для организма человека лекарственных препаратов, обладающих низким общетоксическим действием и отсутствием побочных эффектов, является актуальной задачей. В этой связи все большее внимание уделяется исследованию химических соединений, перспективных для использования в качестве лекарств, на микробиом человека [Marchesi, Ravel, 2015]. Активность микроорганизмов, входящих в микробиом, играет важную роль в пищеварении, секреции полезных метаболитов, в том числе витаминов К и группы В. Бактерии способны к биотрансформации лекарственных препаратов, изменяя их биологическую активность [Enright et al., 2016]. При пероральном применении лекарственного вещества происходит его взаимодействие с представителями кишечной микрофлоры, которое может привести к изменению микробиомного состава. Изменения в составе микробиома коррелируют с заболеваниями желудочно-кишечного тракта и нервной системы [Kho, Lal, 2018; Rowland et al., 2018].

Целью настоящей работы является изучение влияния трех представителей оксопроизводных азотсодержащих гетероциклов (ОАГ), планируемых к использованию в качестве лекарственных препаратов, на микробиом лабораторных крыс. Представители (ОАГ), содержащие енаминоновый фрагмент (N–C=C– C=O), рассматриваются как универсальные блоки для создания новых биологически активных молекул. Среди представителей этой группы были обнаружены вещества, обладающие противомикробной, анальгетической, противовоспалительной, противосудорожной, противораковой активностью [Boteva et al., 2019; Jiang et al., 2020; Gao et al., 2023].

В настоящее время резко возрастает число работ по исследованию количественных и качественных характеристик микробиома человека и животных. Актуально изучение влияния различных факторов на эти характеристики и поиск оптимального набора методов и подходов для изучения действия перспективных химических соединений на микробиом. Настоящая работа вносит вклад в решение этой проблемы. Полученные данные могут быть использованы для определения корреляции между структурами веществ и их свойствами и прогноза возможных взаимодействий с кишечными бактериями.

Материалы и методы исследования

Забор образцов кала проводили в рамках исследования субхронической токсичности на лабораторных крысах линии Sprague Dawley. Животные были разделены на 4 группы (по 3 самца и 3 самки в группе). Введение исследуемых веществ проводили per os ежедневно в течение 14 дней. Исследуемая доза препаратов – 30 мг/кг, соответствует двум терапевтическим дозам. Суспензию веществ готовили ежедневно путем перетирания навески с 1%-ной крахмальной слизью. Расчет объема введения проводили индивидуально для каждого животного, исходя из соотношения 0.1 мл суспензии на 100 г веса крысы. Животным контрольной группы вводили 1%-ную крахмальную слизь. Забор образцов кала проводили до начала введения веществ и после полного курса введения.

Секвенирование образцов кала крыс проводили с использованием оборудования ЦКП «Геном» института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН при непосредственном участии соавтора настоящей статьи Г.А. Триандафиловой.

Замороженные образцы помещали в контейнер со льдом для разморозки на 30 мин. Шпателем отбирали навеску образца массой 10 мкг и помещали в пробирки для гомогенизации, содержащие керамические шарики MagNA Lyser Green Bead (Roche, Швейцария). К навеске образца добавляли 500 мкл лизирующего буфера MagNA Pure Bacteria Lysis Buffer (Roche, Германия). Далее образцы гомогенизировали с помощью автоматического гомогенизатора MagNA Lyser (Roche, Швейцария) согласно инструкции производителя, после чего добавляли 20 мкл протеиназы K (Qiagen, Германия) и инкубировали в течение 30 мин. при 65°C, затем еще 10 мин. при 95°C. Затем образцы центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 2 мин. Из полученного супернатанта (400 мкл) выделяли тотальную ДНК на приборе для автомати- ческого выделения нуклеиновых кислот Magna Pure (Roche, Швейцария) с использованием реагентов MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche) согласно инструкции производителя. Выделенную ДНК хранили при –20°C. Для качественной и количественной оценки ДНК использовали NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Подготовка 16S метагеномных библиотек осуществлялась в соответствии с протоколом 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, США). Первый раунд амплификации вариабельных участков V3-V4 гена 16S рРНК проводили с использованием прямого (TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG) и обратного (США). Очищенные ампликоны смешивали эквимолярно, качество приготовленного пула библиотек проводили на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США) с использованием набора Agilent DNA 1000 Kit Bioanalyzer (Agilent Technologies, США). Cеквенирование проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) в режиме парно-концевых прочтений. Данные секвенирования анализировали с использованием MiSeq Reporter (Illumina, США) (GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC) праймеров по программе амплификации (амплификатор Biorad T100, США): 95°C – 3 мин.; 30 циклов: 95°C – 30 с., 55°C – 30 с., 72°C – 30 с.; 72°C – 5 мин.; 4°C. Очистку ПЦР-продуктов осуществляли с использованием шариков Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) в соответствии с протоколом производителя.

Второй раунд амплификации для двойного индексирования образцов осуществляли с использованием комбинации специфических индексов Nextera XT Index kit (Illumina, США). Программа амплификации (амплификатор Biorad T100): 95°C – 3 мин.; 8 циклов: 95°C – 30 с., 55°C – 30 с., 72°C – 30 с.; 72°C – 5 мин.; 4°C.

Очистку ПЦР-продуктов осуществляли с использованием шариков Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию полученных библиотек определяли с помощью флуориметра Qubit® 2.0 (Invitrogen, США) с использованием набора dsDNA High-Sensitivity Assay Kit (Invitrogen, США). Очищенные ампликоны смешивали эквимолярно, качество приготовленного пула библиотек проводили на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США) с использованием набора Agilent DNA 1000 Kit Bioanalyzer (Agilent Technologies, США). Cеквени-рование проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) в режиме парно-концевых прочтений. Данные секвенирования анализировали с использованием MiSeq Reporter (Illumina, США).

Для биоинформатической обработки данных последовательности прямых и обратных прочтений были объединены в единый ампликон при помощи MeFiT. Далее для анализа ампликонов использовали программное обеспечение DADA2. После удаления последовательностей праймеров и фильтрации прочтений по их качеству были выделены последовательности RSV (ribosomal sequence variant). Химерные RSV были исключены из анализа. Аннотация окончательного списка RSV проводилась также при помощи DADA2 и базы данных Silva 138.1. Далее был проведен подсчет индексов альфа-разнообразия, оценено бета-разнообразие по различным метрикам (пакеты vegan, fossil) и проведено сравнение относительной представленности таксонов между группами с учетом композиционности данных по микробиому (пакет ALDEx2). Достаточность глубины секвенирования (количества прочтений) проверяли с помощью анализа кривых разрежения (на уровне RSV, родов и семейств).

Результаты и их обсуждение

Изучалось влияние на микробиом кишечника крыс трех соединений, относящихся к разным классам оксопроизводных азотсодержащих гетероциклов: CBR-384, CBR-376 и CBR-124. Предварительные эксперименты показали высокую биологическую активность этих соединений по нескольким физиологическим параметрам на бактерии Escherichia coli , являющиеся одним из компонентов микробиома человека и животных [Triandafilova et al., 2023].

Секвенирование фрагментов гена 16S рРНК, полученных из фекалий крыс до начала введения исследуемых веществ, показало гетерогенность микробиомных сообществ разных особей. Большинство бактерий микробиомных сообществ ЖКТ принадлежали к филумам Firmicutes (57%), Verrucomicrobiota (23%) и Actinobacteriota (9%). Среди бактерий филума Firmicutes большинство бактерий относились к классам Clostridia (80%) и Bacilli (18%). Филум Verrucomicrobiota был представлен классом Verrucomicrobiae , филум Actinobacteriota – классом Coriobacteriia .

После двухнедельного введения крахмальной слизи наблюдалось значимое изменение состава микробиомов даже на уровне филумов во всех группах. Так, в контрольной группе, получавшей крахмальную слизь, достоверно уменьшилось количество представителей филума Patescibacteria в 4.7 раза за счет бактерий рода Candidatus saccharimonas. Представители данного филума являются в основном обитателями грунтовых вод и озер [Tian et al., 2020]. Однако бактерии порядка Saccharimonadales были обнаружены в ротовой полости человека, кишечнике и на кожных покровах, а их присутствие коррелировало с воспалительными заболеваниями слизистых покровов [Gámez-Valdez et al., 2021]. Кроме того, у 5 из 6 животных наблюдалось уменьшение количества бактерий вида Akkermansia muciniphila, как минимум в 2 раза, относящихся к филуму Verrucomicrobia. Akkermansia muciniphila играет ключевую роль в формировании микробного сообщества на границе слизистой оболочки и клеток кишечника человека, т.к. способна метаболизировать муцин [Derrien et al., 2017]. По последним данным, снижение количества этих бактерий в кишечнике коррелирует с развитием воспалительных процессов и нарушением обмена веществ в организме человека [Chen et al., 2023]. В то же время значительно увеличилось количество бактерий, относящихся к классу Clostridia, за счет представителей отрядов Clostridia UCG-014, Oscillospirales и Monoglobales. Примечательно, что бактерии отрядов Clostridia UCG-014 и Monoglobales не обнаружены в образцах, взятых до введения крахмальной слизи. Эти бактерии принадлежат к очень широкому и гетерогенному классу, среди которых есть патогенные виды, а также бактерии, продуцирующие полезные короткоцепочечные жирные кислоты. Роль отряда Clostridia UCG-014 пока недостаточно изучена, однако результаты секвенирования показывают, что данные бактерии часто встречаются в микробиомном сообществе кишечника человека. Oscillospirales, судя по всему, также являются представителями нормальной микрофлоры кишечника, а их количество напрямую коррелирует с отсутствием у человека проблем с избыточным весом и нормальным уровнем холестерина в крови. Сами бактерии являются продуцентами короткоцепочечных жирных кислот, например, бутирата, и рассматриваются в качестве пробиотиков [Yang et al., 2021].

Соединение CBR-384 наибольшее влияние оказало на бактерии вида Akkermansia muciniphila , относящегося к филуму Verrucomicrobia , – их количество увеличилось в 3.6 раза. При этом в контрольной группе наблюдалась противоположная тенденция. Как и при введении крахмальной слизи, более чем в 100 раз увеличилось количество бактерий отряда Clostridia UCG-014 . Также в 1.8 раза увеличилось количество бактерий семейства Lactobacillaceae , относящегося к классу Bacilli филума Firmicutes . Данные бактерии являются важными представителями сообщества молочнокислых бактерий кишечника и отвечают за превращение лактозы и других углеводов в молочную кислоту [Heeney et al., 2018]. CBR-384 вызвал достоверное снижение количества представителей классов Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria филума Proteobacteria в 16 и 10 раз соответственно. Класс Alphaproteobacteria в основном был представлен семействами Rhizobiaceae и Caulobacterales . Большинство представителей Rhizobiaceae относятся к симбионтам растений, способным связывать азот. Однако они встречаются и в кишечнике крыс [Liu et al., 2018]. Члены семейства Caulobacterales были выделены из пресной воды, почвы, морской воды, растений, животных и человека. Некоторые виды данного семейства являются патогенными [Abraham et al., 2014]. Снижение количества представителей класса Gammaproteobacteria произошло за счет семейств Xanthomonadaceae (в 12 раз), Enterobacterales (в 7 раз) и Pseudomonadaceae (в 11 раз). Бактерия Stenotrophomonas maltophilia , относящаяся к классу Xanthomonadaceae , встречается во многих местах обитания. Она представляет серьезную опасность для людей с иммунодефицитом, т.к. обладает множественной устойчивостью к антибиотикам и все чаще колонизирует катетеры и протезы [An & Berg, 2018]. В результате воздействия CBR-384 наблюдалось снижение количества S. maltophilia в 12 раз. Также данное вещество способствовало уменьшению в 10 раз количества другого патогена – представителя рода Shigella , относящегося к классу Enterobacterales. Кроме патогенов, CBR-384 вызвал уменьшение количества некоторых бактерий – представителей нормальной микрофлоры кишечника. Так, в 4 раза снизилось количество бактерий, относящихся к семейству Eggerthellaceae класса Coriobacteriia . Бактерии данного семейства более характерны для микрофлоры кишечника грызунов [Hoyles, 2019]. Известно, что некоторые представители Eggerthellaceae способны метаболизировать изофлавоны [Soukup et al., 2021]. Другие бактерии, представители нормальной микрофлоры кишечника, количество которых уменьшилось в 2.3 раза, относятся к семейству Lachnospirales класса Clostridia . Представители данного семейства являются облигатными анаэробами и способны метаболизировать различные растительные полисахариды до короткоцепочечных жирных кислот и спиртов. Несмотря на способность бактерий продуцировать полезные для человека метаболиты, накапливаются данные о взаимосвязи этих бактерий с ожирением, болезнями печени и диабетом [Vacca et al., 2020].

При действии CBR-376 на микробиом кишечника крыс, в отличие от контрольной группы, наблюдалось сохранение количества бактерий Akkermansia muciniphila филума Patescibacteria. При этом в 12.9 раз уменьшилось количество представителей рода Lachnospiraceae UCG-006. Как отмечалось ранее, увеличение соотношения Akkermansia / Lachnospiraceae рассматривается как положительное изменение микробиомного состава [Chen et al., 2023]. Как и в контрольной группе, сохранилось увеличение количества бактерий класса Clostridia за счет представителей отрядов Clostridia UCG-014, Oscillospirales, Monoglobales. Также под действием данного вещества произошло увеличение количества бактерий рода Lactobacillus в 10 раз и бактерий класса Vampirivibrionia в 5 раз. Представители филума Cyanobacteria, а конкретно класса Vampirivibrionia, являются единственными нефотосинтезирующими цианобактериями, обнаруженными в ЖКТ человека. Несмотря на большое количество исследований взаимосвязи количества этих бактерий с различными заболеваниями человека, достоверных сведений о положительной либо отрицательной их роли нет [Hoyles, 2019]. В группе CBR-376 наблюдалось увеличение количества представителей класса Gammaproteobacteria, которое произошло за счет семейств Xanthomonadaceae (в 2 ра- за), Enterobacterales (в 3 раза) и Pseudomonadaceae (в 10 раз). Поскольку среди представителей данного класса достаточно часто встречаются патогенные и условно-патогенные бактерии, увеличение количества таких бактерий, вероятно, стоит рассматривать как негативное событие.

В группе животных, получавших соединение CBR-124, наблюдались изменения микробиомного состава, близкие к тем, которые наблюдались в контрольной группе. Снизилось количество бактерий фи-лумов Patescibacteria и Verrucomicrobia , в основном, за счет бактерий рода Candidatus Saccharimonas в первом случае и бактерий вида Akkermansia muciniphila во втором случае. Одновременно увеличивалось количество бактерий класса Clostridia и семейства Lactobacillaceae класса Bacilli.

Заключение

Изучено влияние на микробиом кишечника крыс трех соединений, относящихся к разным классам оксопроизводных азотсодержащих гетероциклов (CBR-384, CBR-376 и CBR-124) и обладающих высокой биологической активностью по нескольким физиологическим параметрам на бактерии Escherichia coli , одного из компонентов микробиома человека и животных. Установлено, что из трех соединений наибольшее влияние на микробиомный состав кишечника крыс оказывает соединение CBR-384. Вызванные им уменьшение количества патогенных бактерий и увеличение бактерий полезной микрофлоры позволяют рассматривать данное вещество в качестве потенциального модулятора микрофлоры кишечника человека. Соединение CBR-376 вызывало увеличение количества как полезных бактерий, так и представителей классов, содержащих патогены. При дальнейшей разработке на базе данной молекулы лекарственного средства необходимо учитывать возможность негативного влияния данного вещества на микрофлору. Третье соединение (CBR-124) не оказывало значительного влияния на микробный состав кишечника крыс. Стоит отметить, что широко используемая в фармакологических экспериментах матрица для введения исследуемых химических веществ – крахмальная слизь – сама способна вызывать изменения микробиомного состава. Данный факт необходимо учитывать при планировании дизайна эксперимента и обработке полученных данных.