Исследование влияния препарата аминокислот с разветвленными боковыми радикалами на регенерацию передней большеберцовой мышцы после компрессионной травмы

Лечение пострадавших с травмами опорно-двигательной системы остается сложной медицинской проблемой [1–3]. Повреждения скелетных мышц составляют около 30 % [4], а современные методы терапии в большинстве случаев направлены на уменьшение боли и воспаления с помощью нестероидных противовоспалительных препаратов, иммобилизации и внешних физических стимуляций [5, 6]. При тяжелых травмах происходит рабдомиолиз (разрушение скелетных мышц), характеризующийся повреждением мышечных клеток с выходом миоглобина и саркоплазматических белков во внеклеточную жидкость [7, 8]. К наиболее распространенным причинам рабдомиолиза относят компрессионные травмы [9], при которых в тканях скелетных мышц определяют ишемический некроз с последующим развитием грануляционной ткани и формированием мышечно-соединительнотканного регенерата [10]. Несмотря на способность скелетных мышц восстанавливаться благодаря популяции стволовых клеток [11, 12], имеющийся резерв миосателлитоцитов при таких серьезных поражениях, как правило, не обеспечивает полной гисто- и органотипической регенерации [13, 14], что приводит к потере сократительной ткани, замене ее жировой и фиброзной рубцовой тканями, вызывает долгосрочный дефицит мышечной структуры и силы [5]. Таким образом, правильная регенерация скелетных мышц играет ключевую роль в восстановлении их функции после травмы [15].

Существующие методы лечения остаются недостаточно эффективными [16], что обуславливает востребованность в клинической практике фундаментальных исследований по разработке новых способов индукции репаративного рабдомиогенеза и редуцировании фиброза [5, 13, 14]. Множество исследований последних лет сосредоточены на изучении молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации мышц [17], на поиске активаторов миогенеза мышечных клеток-предшественников и ангиогенеза эндотелиальных клеток [18, 19]. Известно, что такими свойствами обладают незаменимые аминокислоты с разветвлёнными боковыми радикалами ( англ .: Branched-Chain Amino Acids, BCAA), — лейцин, изолейцин и валин. Они являются мощными регуляторами синтеза белка в здоровых скелетных мышцах и при мышечной атрофии, а лейцин используют в качестве «фармацевтического питательного вещества» для предотвращения атрофии и восстановления мышц у пожилых людей [20]. В качестве пищевых добавок BCAA нашли широкое применение для восстановления повреждения мышц и облегчения отсроченной мышечной боли, вызванной физическими нагрузками [21]. Доказано, что внутрибрюшинное введение мышам лейцина снижает атрофию мышц и способствует поддержанию мышечной массы во время сепсиса [22]. Ортопедические операции и связанные с ними события (иммобилизация либо длительное бездействие мышц) приводят к значительной потере мышечной массы и длительному снижению функции [23, 24]. Пероральный прием BCAA у таких пациентов улучшает качество и массу мышц по сравнению с плацебо [25, 26]. Есть сведения о положительном опыте периоперационного внутривенного введения аминокислот пациентам при плановом тотальном эндопротезировании тазобедренного сустава для компенсации потери белка скелетных мышц, индуцированных хирургическим вмешательством [27, 28]. Данные о доклинических исследованиях эффективности внутримышечного введения препарата BCAA в зоне повреждения единичны [29], а гистологические данные о его влиянии на регенерацию мышц в релевантной литературе отсутствуют, что и определило цель данной работы.

Цель работы — гистоморфометрическая оценка влияния внутримышечного введения препарата BCAA в лекарственной форме для инъекций на регенерацию передней большеберцовой мышцы крыс после ее закрытого частичного раздавливания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Исследование — интервенционное (экспериментальное), одноцентровое, проспективное, выборочное, контролируемое, рандомизированное.

Описание эксперимента

Закрытое частичное раздавливание передней большеберцовой мышцы (ПБМ) при помощи корнцанга хирургического проводили 48 крысам линии Вистар (самцы, возраст — восемь месяцев, средняя масса — 462 (454; 477) г). Животные разделены на две группы: животным серии 1 ( n = 24) в ПБМ разово вводили физраствор, животным серии 2 ( n = 24) — препарат аминокислот с разветвлёнными боковыми радикалами.

Для стандартизации экспериментальной модели корнцанг располагали перпендикулярно продольной оси голени таким образом, чтобы его губки при смыкании оказывали давление на ткани в области середины брюшка ПБМ. Кольца корнцанга направляли краниально, замок-клемальеру защелкивали во всех случаях в одинаковом положении на одну минуту. Экспериментальная модель полностью воспроизводима [30].

Процедуру проводили в операционной под общим наркозом препаратами Рометар 2 % (Биовета, Чехия) и Золетил 100 (Virbac Sante Animale, Франция). Через 24 часа животным серии 1 в травмированный участок мышцы вводили 0,02 мл физиологического раствора, животным серии 2 — 0,02 мл раствора аминокислот на физиологическом растворе (L-валин : L-изолейцин : L-лейцин в равных весовых отношениях, из расчета по 0,04 г каждой аминокислоты в 10 мл физиологического раствора). В обеих сериях инъекции выполняли разово.

Далее крыс содержали в клетках по две особи, выводили из эксперимента на седьмые, 14-е, 28-е и 42-е сутки после травмы ( n = 6 в каждой серии на всех сроках опыта).

Методы . Фрагменты ПБМ, иссеченные из области компрессионной травмы, фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. Поперечные парафиновые срезы (5 мкм) готовили на микротоме НМ 450 Thermo Scientific (США), окрашивали трехцветным методом по Массону, гематоксилином и эозином. Часть материала после альдегидно-осмиевой фиксации заключали в арал-дит, на ультрамикротоме Nova LKB (Швеция) изготавливали полутонкие срезы (1 мкм), окрашивали метиленовым синим, азуром II и основным фуксином.

Полноцветные цифровые изображения получали с помощью микроскопа AxioScope.A1 и цифровой камеры AxioCam (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия). С использованием электронной версии оригинальной тестовой решетки равноудаленных точек [31] в программе PhotoFiltre 7.0 на 14-е, 28-е и 42-е сутки после травмы рассчитывали стереологические параметры: объемные плотности мышечных волокон ( V Vm ), микрососудов ( V Vmv ) и эндомизия ( V Vе ). В программе «ВидеоТесТ Мастер-Морфология, 4.0» (Россия) измеряли средние диаметры мышечных волокон (до 400 у каждого животного), определяли численные плотности мышечных волокон ( Na m ), микрососудов ( Na mv ) и внутримышечных ядер ( Na n ) в 1 мм ² площади, рассчитывали коэффициенты васкуляризации ( kv как Na mv / Na m ) и нуклеации ( kn как Na n / Na m ). Во внутримышечных нервных стволиках определяли долю (%) реактивно-деструктивно измененных миелиновых нервных волокон в общем объёме выборки. Контроль — 10 интактных крыс (самцы, возраст 8–9 месяцев).

В динамике эксперимента оценивали двигательную активность крыс в тесте «открытое поле». Животных в одно и то же время (в 11:00) помещали в круглый манеж диаметром 120 см, дно которого было разлиновано на квадраты стороной 12 см. После адаптации животного (через одну минуту после посадки) в течение одной минуты выполняли видеосъемку, по результатам которой фиксировали общее количество пересечений квадратов.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено локальным этическим комитетом (протокол от 29.11.2024 № 1(76)), проведено с соблюдением требований Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

Статистический анализ

Объем выборок рассчитывали на основании минимального количества, необходимого для получения достоверных результатов. Статистическую обработку данных выполняли в компьютерной программе AtteStat версия 9.3.1 (разработчик И.П. Гайдышев, сертификат о регистрации в Роспатенте № 2002611109, Россия). Проверку выборок на нормальность распределения значений осуществляли с помощью критерия Колмогорова. Для попарного сравнения групп животных использовали критерий Манна – Уитни. Отличия считали значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатели двигательной активности, согласно тесту «открытое поле», у крыс серии 1 к концу периода наблюдения (42-е сутки) были значимо ниже исходных значений и составили в среднем 13,0 (12,0–14,0) пересечений квадратов против исходных 19,5 (16,8–24,3), р = 0,007. В серии 2 уже на 28-е сутки после травмы отмечали отсутствие статистически значимых различий с исходными показателями, — 15,5 (12,3–18,0) пересечений квадратов против исходных 18,5 (15,8–26,0), р > 0,05.

Через семь суток после травмы в ПБМ обеих серий выявили схожую морфологическую картину, — в поверхностном слое и зоне прилегания мышцы к большеберцовой кости обнаружены деструктивно измененные мышечные волокна (МВ), регенерирующие МВ и участки грануляционной ткани. В поперечных срезах видна дезорганизация части фасцикул, отек эндомизия, его гиперваскуляризация, повышение клеточности с преобладанием фибробластов, фиброцитов и макрофагов. МВ имеют меньший диаметр, округленные контуры (рис. 1, а, б). Внутримышечные ядра располагаются как по периферии, одиночно, иногда цепочками либо конгломератами, так и в центральной части волокон, часть регене- рирующих волокон находится на стадии миотуб (рис. 1, в). Миелиновые нервные волокна внутримышечных нервных стволиков через семь суток опыта в обеих сериях деструктивно изменяются (рис. 1, д). В продольных срезах на этом сроке опыта обнаружены МВ без поперечной исчерченности, встречаются участки с волнообразно извитыми МВ неравномерной толщины, часть из них — с нарушенной целостностью и участками некробиоза, тонкие регенерирующие МВ с выстроенными в цепочки либо агломерированными ядрами, волокна в стадии миотуб (рис. 1, г) и редкие расширенные на концах МВ со скоплениями внутримышечных ядер («мышечные почки») (рис. 1, е).

Рис. 1. Передние большеберцовые мышцы крыс через семь суток (а — серия 1; б–д — серия 2) и через 14 суток (е — серия 2) после компрессионной травмы. Поперечные парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином (в, г, е) и трехцветным методом по Массону (а, б), увеличение 400×. Поперечный полутонкий срез (д), окраска метиленовым синим, азуром II и основным фуксином, увеличение 1000×

Через 14 и 21 сутки опыта в обеих сериях в поверхностной и глубокой зонах преобладают регенераторные процессы. МВ имеют преимущественно округлую форму с периферическим либо центральным расположением ядер (рис. 2, а, б), продолжают встречаться миотубы, а в продольных срезах — гофрированные волокна, булавовидно расширенные на концах МВ со скоплениями ядер («мышечные почки») (рис. 1, е). Интерстициальные пространства остаются расширенными с повышенным содержанием фибробластов и фиброцитов.

На 42-е сутки после травмы в поверхностной и глубокой зонах МВ полиморфны, встречаются мелкие регенерирующие волокна, имеющие округлые контуры, часть МВ приобретает полигональную форму. Ядра занимают как периферическое, так и центральное расположение, интерстициальные пространства остаются расширенными (рис. 2, г, д) в обеих сериях.

Во внутримышечных нервных стволиках через 14 суток преобладают деструктивно измененные нервные волокна, а через 21 сутки и в конце опыта — нервные волокна нормального строения (рис. 2, в, е).

В слое передней большеберцовой мышцы между поверхностной и глубокой зонами в обеих сериях на всех сроках опыта сохраняется пучковая структура, но прослойки эндомизия утолщены. Часть МВ имеет нормальное строение, полигональную форму, часть — скругленные либо спавшиеся контуры, смещенные к центру ядра, неравномерное окрашивание, вакуолизацию. Дистрофические изменения становятся менее выраженными к концу опыта.

Гистоморфометрическое исследование размерных и численных характеристик МВ показало, что через семь суток в сериях 1 и 2 их медианный диаметр снижен (рис. 3, а) на 50 % ( р = 0,0001) и 39 % ( р = 0,003), а их численные плотности превышают норму в 2,8 ( р = 0,00002) и 1,7 ( р = 0,0005) раза соответственно (рис. 3, б). Через 14 суток опыта диаметр МВ в сериях 1 и 2 возрастает относительно предыдущего срока и составляет 59 % ( р = 0,001) и 67 % ( р = 0,0013) от нормы соответственно (рис. 3, а). Численная плотность МВ в серии 2 возрастает, и в обеих сериях превышает норму ( р = 0,0002) в 2,6 раза (рис. 3, б).

Рис. 2. Передние большеберцовые мышцы крыс через 21 сутки (а — серия 1; б, в — серия 2) и на 42-е сутки (г — серия 1; д, е — серия 2) после компрессионной травмы. Поперечные парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином (а, б, г, д), увеличение 400×. Поперечные полутонкие срезы (в, е), окраска метиленовым синим, азуром II и основным фуксином, увеличение 1000× (в), 400× (е)

Рис. 3. График изменения диаметра (мкм) мышечных волокон (а) и численной плотности (в 1 мм2 площади среза) мышечных волокон (б) передних большеберцовых мышц серий 1 и 2 на этапах эксперимента (Me (Q1; Q3))

Стереологическое исследование показало, что в сериях 1 и 2 V Vm снижена ( р < 0,001) относительно параметров интактной мышцы на 37,6 % и 36,5 %, V Vе повышена на 34,7 % и 34,2 %, V Vmv повышена в 2,5 и 2,2 раза соответственно (табл. 1). Сравнение серий 1 и 2 не выявило значимых различий по данным параметрам.

Через 28 суток диаметр МВ в сериях 1 и 2 возрастает и составляет 79 % ( р = 0,007) и 84 % ( р = 0,004) от нормы (рис. 3, а), а численная плотность МВ снижается относительно предыдущего срока, но превышает норму в 2,5 ( р < 0,001) и 1,8 ( р = 0,006) раза соответственно (рис. 3, б).

Стереологический анализ показал, что V Vm возрастает в сериях 1 и 2 на 6,8 % и 11,3 %, но остается сниженной ( р < 0,001), а V Vе и V Vmv остаются повышенными ( р < 0,001) относительно интактных значений (табл. 1). Сравнение опытных серий показало, что в серии 2 V Vm на 5,6 % выше, а VVе на 5,5 % ниже ( р < 0,001) значений серии 1 (табл. 1), а значимые различия по V Vmv отсутствуют (табл. 1).

В конце опыта (42-е сутки) диаметр МВ в серии 1 не восстанавливается и составляет 75 % ( р = 0,0005) от нормы (рис. 3, а), а численная плотность МВ повышена ( p = 0,006) в 1,8 раза (рис. 3, б). В серии 2 численная плотность МВ возрастает, а диаметр снижается относительно предыдущего срока, составляя 53 % ( р = 0,0006) от нормы (рис. 3, а, б). Соотношение долей тканевых компонентов в обеих опытных сериях не восстанавливается до нормальных значений: V Vm остаются сниженными ( р < 0,001), но в серии 2, как и через 28 суток, значение V Vm выше, чем в серии 1, на 5,7 % ( р < 0,001), а V Vе ниже ( р < 0,001) на 5,6 % (табл. 1). Значимые различия по параметру V Vmv между сериями 1 и 2 отсутствуют.

Таблица 1

Объемные плотности тканевых компонентов (в %) интактной передней большеберцовой мышцы в опытных сериях на этапах эксперимента (M ± σ)

Срок опыта	Серия	Объемная плотность
		мышечных волокон	микрососудов	эндомизия
14 суток	Серия 1	54,9 ± 3,2; pн = 4·10–8*; p1–2 = 0,184	5,0 ± 1,4; pн = 9·10–7*; p1–2 = 0,069	40,2 ± 3,4; pн = 4·10–8*; p1–2 = 0,273
	Серия 2	56,0 ± 13,1; pн = 4·10–8*	4,4 ± 0,8; pн = 1·10–7*	39,7 ± 12,9; pн = 4·10–8*
28 суток	Серия 1	61,7 ± 6,4; pн = 4·10–8*; p1–2 = 0,001*	4,8 ± 1,3; pн = 4·10–7*; p1–2 = 0,882	33,5 ± 6,7; pн = 4·10–8*; p1–2 = 0,002*
	Серия 2	67,3 ± 5,3; pн = 4·10–8*	4,8 ± 0,9; pн = 9·10–8*	28,0 ± 5,4; pн = 4·10–8*
42-е сутки	Серия 1	60,4 ± 5,0; pн = 4·10–8*; p1–2 = 0,002*	4,4 ± 0,7; pн = 8·10–8*; p1–2 = 0,694	35,3 ± 4,8; pн = 4·10–8*; p1–2 = 0,001*
	Серия 2	66,1 ± 4,6; pн = 4·10–8*	4,3 ± 0,7; pн = 4·10–8*	29,7 ± 4,6; pн = 4·10–8*
Интактная мышца		92,5 ± 1,6	2,0 ± 0,7	5,5 ± 1,4

* — различия между экспериментальными сериями и нормой ( p^н ), сериями 1 и 2 ( p^1–2 ) считали статистически значимыми по критерию Манна – Уитни при р < 0,05.

Анализ распределения МВ по диаметрам показал, что в обеих сериях на всех сроках эксперимента гистограммы сохраняют унимодальный характер, но их основания смещаются относительно нормы влево (рис. 4). Через семь суток в серии 1 (рис. 4, а) доля мелких регенерирующих и атрофированных мышечных волокон ( D < 30 мкм) составляет 84 % (в норме — единичны, 1 %), к 42-м суткам снижается до 44 %, а крупные волокна ( D < 50) на всех сроках (рис. 4) составляют 1–2 % (в норме — 62 %). В серии 2 через семь суток (рис. 4, а) доля мелких волокон ( D < 30) мкм составляет 60 %, снижается через 28 суток до 29 %, но снова возрастает к 42-м суткам опыта до 67 %, а крупные мышечные волокна ( D > 50) на всех сроках составляют 3–5 % (рис. 4). В конце эксперимента в серии 2 мода смещается влево (рис. 4, г) в диапазон меньших значений — 11–20 мкм (в серии 1 — 31–40 мкм).

0-10 мкм 11-20 мклл 21-30 мкм 31-40 мкм 41-5 0 мкм 51-60 мкм 61-70 мкм 71-80 мкм 81-90 мкм

■ интактная мышца ■ 1 серия

■ 2 серия

Рис. 4. Гистограммы распределения мышечных волокон передней большеберцовой мышцы по диаметрам крыс интактной группы, серии 1 и серии 2 через семь (а), 14 (б), 28 (в) и 42 (г) суток эксперимента. Ось абсцисс — диаметры волокон (мкм), ось ординат — процентные доли волокон в выборке

Параметры Na mv и Na n в 1 мм ² превышают норму в обеих сериях на всех сроках опыта (табл. 2), но при этом kv в серии 1 остается сниженным через семь, 14, и 28 суток в 1,6, 1,6 и 1,3 раза соответственно, и превышает норму в 1,3 раза только на 42-е сутки (табл. 2). В серии 2 через 7 и 14 суток kv снижен в 1,6 и 1,4 раза, через 28 превышает норму в 1,1 раза, но на 42 сутки снижен в 1,9 раза (табл. 2). Следует отметить, что через семь суток достоверные различия по этому параметру между сериями отсутствуют, через 14 и 28 суток коэффициент васкуляризации достоверно повышен в серии 2, но к концу опыта его значение становится в 2,3 раза ниже, чем в серии 1 (табл. 2).

Коэффициент нуклеации в серии 1 в течение 14 суток снижен в 1,3 раза, к 28-м суткам возрастает и превышает норму в 1,2 раза, а на 42-е сутки снижен в 1,1 раза (табл. 2). В серии 2 данный показатель снижен в 1,2 раза только через семь суток опыта, через 14 суток превышает норму в 1,1 раза, а в остальные сроки имеет нормальные значения (табл. 2). Коэффициент нуклеации в серии 2 превышает значения серии 1 через 14 суток в 1,4 раза, и становится ниже в 1,3 раза на 28-е сутки, в конце опыта достоверные различия между сериями отсутствуют (табл. 2).

Таблица 2

Количественные показатели васкуляризации и нуклеации интактной передней большеберцовой мышцы и опытной на этапах эксперимента: Me (Q1; Q3)

Срок опыта	Серия	Na mv	Na n	kv	kn
7 суток	Серия 1	1315 (981; 1526) pн = 0,0001* p = 0,02*	1370 (877; 1755) pн = 0,0015* p = 0,002*	1,11 (0,89; 1,19) pн = 0,0031* p = 0,09	1,18 (0,87; 1,38) pн = 0,002* p = 0,049
7 суток	Серия 2	1041 (658; 1315) pн = 0,002*	877 (658; 1863) pн = 0,004*	1,12 (0,91; 1,73) pн = 0,003*	1,29 (1,00; 1,62) pн = 0,0035*
14 суток	Серия 1	1261 (987; 1535) pн = 0,0002* p = 0,04*	1370 (1206; 1754) pн = 0,00002* p = 0,032*	1,08 (0,89; 1,29) pн = 0,002* p = 0,045*	1,18 (1,00; 1,33) pн = 0,004* p = 0,033*
14 суток	Серия 2	1480 (1315; 1644) pн = 0 ,00002*	1863 (1644; 2083) pн = 0,00033*	1,20 (0,83; 1,70) pн = 0,0026*	1,63 (1,31; 1,88) pн = 0,052
28 суток	Серия 1	1425 (987; 2192) pн = 0,0013* p = 0,056	1809 (1315; 2631) pн = 0,00005* р = 0,029*	1,31 (1,00; 1,60) pн = 0,020* р = 0,014*	1,88 (1,36; 2,20) pн = 0,036* р = 0,03*
28 суток	Серия 2	1535 (1096; 1644) pн = 0,0002*	1096 (877; 1315) pн = 0,003*	1,93 (1,25; 2,14) pн = 0,03*	1,50 (1,29; 1,55) pн = 0,131
42-е сутки	Серия 1	1754 (1206; 1836) pн = 0,008* p = 0,028*	1096 (767; 1206) pн = 0,010* p = 0,003*	2,20 (1,43; 2,60) pн = 0,01* p = 0,006*	1,41 (1,00; 1,70) pн = 0,034* p = 0,044*
42-е сутки	Серия 2	987 (767; 1535) pн = 0,04*	1762 (1425; 2521) pн = 0,005*	0,94 (0,64; 1,31) pн = 0,008*	1,53 (0,94; 2,60) pн = 0,371
Интактная группа		767 (658; 1096)	655 (532; 877)	1,75 (1,33; 2,33)	1,56 (1,20; 2,00)

Примечание : Na m — численная плотность мышечных волокон; Na mv — численная плотность микрососудов; Na n — численная плотность внутримышечных ядер ( Na n ) в 1 мм² площади поперечного среза; kv — коэффициент васкуляризации ( Na mv / Na m ), kn — коэффициент нуклеации ( Na n / Na m ). * — различия между экспериментальными сериями и нормой ( p^н ), сериями 1 и 2 ( р ) считали статистически значимыми по критерию Манна – Уитни при р < 0,05.

Морфометрическое исследование внутримышечных нервных стволиков показало, что через семь суток опыта доля (%) деструктивно измененных миелиновых нервных волокон в сериях 1 и 2 составляет (91,8 ± 4,5) % и (94,4 ± 6,1) %, через 14 суток — (88,2 ± 5,3) % и (80,0 ± 7,2) %, через 21 сутки — (27,3 ± 2,8) % и (33,4 ± 6,4) %, и в конце опыта (42-е сутки) — (8,9 ± 3,1) % и (9,5 ± 2,2) % соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании проведена оценка влияния на регенераторные процессы однократного внутримышечного введения в зону закрытого частичного раздавливания ПБМ крыс разработанного авторами препарата BCAA в лекарственной форме для инъекций. Ранее в эксперименте на крысах доказана его безопасность при разовом применении в изученной концентрации, и получены более низкие значения активности креатинфосфокиназы (маркера мышечного повреждения) сыворотки крови животных с инъекцией данного препарата относительно контроля [29].

Известно, что при компрессионном повреждении скелетных мышц вследствие механического сдавления и ишемии-реперфузии травмируются не только мышечные волокна, но и кровеносные сосуды и нервы [30, 32], обширная деградация которых наблюдается в течение дегенеративной и воспалительной фаз [33, 34]. Активация миогенеза мышечных клеток-предшественников и ангиогенеза эндотелиальных клеток имеет решающее значение для регенерации мышц после травмы [35]. Есть данные, что незаменимые аминокислоты с разветвлёнными боковыми радикалами (лейцин, изолейцин и валин) являются активаторами репаративного рабдомиогенеза и ангиогенеза [20].

Выполненное нами стереологическое исследование изменения соотношения тканевых компонентов в ПБМ крыс, регенерирующих после компрессионной травмы, через семь суток выявило равнозначное снижение в обеих сериях (на 36–37 %) доли мышечных волокон и повышение доли эндомизия. В остальные сроки объемная доля мышечных волокон была значимо выше в серии с инъекцией BCAA, но в конце опыта оставалась ниже нормы в обеих группах. Полученные данные согласуются с результатами стереологических исследований Н.А. Щудло с соавт. [30], которые при такой же экспериментальной модели закрытого частичного раздавливания ПБМ крыс, но с меньшей продолжительностью компрессии (20 с) не выявили полного восстановления объемной доли мышечных волокон даже через 90 дней после травмы.

Для оценки эффективности регенерации мышц после травматических и денервационных повреждений наиболее часто используют показатель «средний либо медианный диаметр мышечных волокон» [30, 36–38]. Проведенный нами количественный анализ популяции мышечных волокон, регенерирующих после закрытого частичного раздавливания, показал, что в течение 28-и суток опыта их медианный диаметр был значимо выше в серии с инъекцией препарата BCAA. Кроме того, в этой серии индекс нуклеации (число ядер в профиле поперечного сечения одного мышечного волокна) был значимо снижен относительно нормы только через семь суток опыта, а в серии без воздействия — на седьмые, 14-е и 42-е сутки. Более низкие значения данного показателя в серии с естественной регенерацией могут свидетельствовать о менее активном миогенезе, так как, по данным литературы, именно активация миосателлитоцитов является одним из главных факторов, определяющих способность скелетной мышцы к регенерации [39]. В конце опыта (42-е сутки) диаметр мышечных волокон в обеих сериях не достигает нормальных значений и даже снижается, но значимо только в серии с инъекцией BCAА, в которой повышается доля мелких волокон диаметром 10–30 мкм одновременно с ростом численной плотности и более высокими, чем в серии 1, значениями объемной плотности мышечных волокон. Такая динамика может быть связана со стойкой атрофией части мышечных волокон, гиперпластическим регенераторным ответом в виде расщепления мионов и их дистрофическими изменениями [30], связанными с нарушением кровоснабжения и иннервации. Так, в нашем исследовании в течение 28-и суток индекс васкуляризации мышечных волокон (число сосудов, питающих одно мышечное волокно) был значимо выше в серии с BCAA, но к 42-м суткам после травмы оказался ниже значений серии 1 и нормы. Известно, что скорость регенерации мышц и полнота восстановления мышечной ткани напрямую зависит от ангиогенеза, восстановления микрососудистой сети [40]. Густая сосудистая сеть может быть более важна для быстрого восстановления мышечных повреждений, чем обилие сателлитных клеток, а более низкая плотность капилляров может ослабить регенерацию [41].

Иннервация ПБМ в проекции компрессионной борозды, как показало наше исследование, нарушается в обеих сериях в равной степени вследствие деструкции миелиновых нервных волокон внутримышечных нервных стволиков и не восстанавливается к концу эксперимента, что также является одной из причин атрофии мышечных волокон [42], сохраняющейся до конца опыта. Денервированные скелетные мышцы теряют свою сократительную функцию, что приводит к снижению перфузии крови и состоянию гипоксии мышцы, избыточному производству активных форм кислорода и повреждению мышечных волокон вследствие окислительного стресса [43].

Таким образом, результаты проведенного нами морфологического, стереологического и морфометрического исследований ПБМ после компрессионной травмы дают основание считать, что применение одной инъекции BCAА оказывает положительное влияние на регенерацию мышечных волокон и микрососудов. Она более активна, чем при спонтанном течении.

Требуются дальнейшие исследования влияния препарата BCAA в лекарственной форме для инъекций на регенерацию мышц с коррекцией дозировки, графика, количества инъекций, изучение адаптивных реакций и потенциальных побочных эффектов и отдаленных результатов для подтверждения его эффективности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Однократное внутримышечное введение в зону закрытого частичного раздавливания передней большеберцовой мышцы крыс оригинального препарата на основе аминокислот с разветвлёнными боковыми радикалами (BCAA) в лекарственной форме для инъекций оказывает миогенный стимулирующий эффект.