Исследование влияния температуры, рН на увеличение биомассы Erysipelothrix rhusiopathiae

Разработка эффективных и безопасных вакцинных препаратов – основы специфической профилактики болезней животных является актуальным. Одним из факторов, определяющих качество питательных сред для производства вакцин, является наличие в их составе стандартных белковых основ [1,2]. Питательными субстратами большинства сред служат белковые гидролизаты различного происхождения. Для интенсификации процесса культивирования бактерий в качестве основы питательных сред успешно применяется дешевое не пищевое сырье и продукты микробиологического синтеза [3]. Для этих целей используют ферментативно-дрожжевой гидролизат (ФКДГ), ферментолизат биомассы микроорганизмов (ФБМ), ферментативный гидролизат казеина, питательная среда из гидролизатов мясокостной муки, гидролизата сыворотки крови, а также двукомпонентная питательная среда из гидролизатов белков крови животных, содержащая источники азота, углерода, минеральные соли и стимулятор роста определенного состава и состоящий из биологически активных веществ из торфа и витаминов. Для повышения выхода целевого продукта в биологической промышленности используется стимулятор роста бактерий из нативной сыворотки крови животных [5,6].

Цель исследований – разработка и усовершенствование технологии получения микробиологических питательных основ и сред для культивирования Erysipelothrix rhusiopathiae.

РН и температура являются определяющими при культивировании м/о. Если рН не соответствует оптимальной величине, то микроорганизмы не могут нормально развиваться, так как активная кислотность оказывает влияние на активность ферментов клетки и проницаемость цитоплазматической мембраны. Некоторые микроорганизмы, образуя продукты обмена и выделяя их в среду, способны изменять реакцию среды. Для бактерий кислая среда более опасна, чем щелочная.

Методика определений

Определение рН питательных сред проводили потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода (МУК 4.2.2316-08) [4]. Прирост или угнетение микроорганизмов определяли на денситометре по оптической плотности с зеленым светофильтром, длина волны 535 +/- 20 нм.

Для культивирования Erysipelothrix rhusiopathiae были подобраны варианты питательных сред, представленных в таблице 1.

Таблица 1 – Состав опытных питательных сред

Компонент	Питательная среда
	1(контроль)	2	3	4	5
Гидролизат Хоттингера	250 г	–	–	–	200 г
Печеночный экстракт	50 г	50 г	50 г	50 г	50 г
Пептон	50 г	50 г	50 г	50 г	5 г
Сухой дрожжевой экстракт	5 г	5 г	5 г	5 г	5 г
Натрий хлористый (NaCl)	2 г	2 г	2 г	2 г	2 г
Однозамещенный фосфорнокислый калий (KH 2 PO 4 )	3 г	3 г	3 г	3 г	3 г
Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na 2 HPO 4 )	18 г	18 г	18 г	18 г	18 г
Глюкоза	2 г	2 г	2 г	2 г	2 г
Нормальная сыворотка крупного рогатого скота	20 г	20 г	20 г	20 г	20 г
L-аргинин	0,5 г	0,5 г	0,5 г	0,5 г	0,5 г
Твин-80	0,5 г	0,5 г	0,5 г	0,5 г	0,5 г
Дистиллированная вода	До 1 л	До 1 л	До 1 л	До 1 л	До 1 л
Соевый концентрат	–	250	–	200	–

В биореактор загружали питательную среду из расчета 2/3 рабочего объема биореактора, а засевная доза составляет 3% к объему питательной среды.

Глубинное культивирование проводили при постоянном перемешивании (100 -150 об/мин), что обеспечило поддержание парциального давления растворенного кислорода (рО 2 ) на уровне 40 - 50 % от насыщения. После окончания культивирования в отдельно взятой пробе из биореактора определяли оптическую концентрацию культуры в пределах (7 ± 2) млрд/мл.

Результаты и обсуждение

Эксперимент проводили на 5 питательных средах.

На рисунках 1-5 представлены динамики роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на разных питательных средах при рН 7,4 и t=36⁰С.

Рисунок 1 – Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №1 (рН 7,4 и t=36⁰С)

На рисунке мы видим, что спустя 4 часа культивирования рост бактерий достигает уровня 2,9, к 24 часам происходит бурное деление клеток и отметка достигает уровня 3,9,т.е. спустя 20 часов рост увеличился на 34,5%.

Рисунок 2 – Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №2 (рН 7,4 и t=36⁰С)

Данный график показывает, что рост бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №2 происходит на 12,8% больше в сравнении с ростом бактерий

Рисунок 3 –Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae штамма М-2 на питательной среде №3 (рН 7,4 и t=36⁰С)

Смотря на график рисунка, мы видим, что наибольшего роста бактерии Erysipelothrix rhusiopathiae достигают спустя 48 часов, достигая отметки 0,9.

Рисунок 4 –-Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №4 (рН 7,4 и t=36⁰С)

Из графика видно, что рост бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №2 за 24 часа увеличился на 45%, а спустя 4 часа понизился на 3%

Рисунок 5 – Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №5 (рН 7,4 и t=36⁰С)

На рисунке 5 мы видим, что максимальный рост бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №2 происходит спустя 24 часа и остается максимальным 2 часа, находясь на отметки 3,5.

На рисунках 6-10 представлены динамики роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на разных питательных средах при рН 6,9 и t=35⁰С.

Рисунок 6 – Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae штамма М-2 на питательной среде №1 (рН 6,9 и t=35⁰С)

Из рисунка можно увидеть, что максимального роста бактерии Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №2 достигают спустя 48 часов. Достигая отметки 0,9.

Рисунок 7 –Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №2 (рН 6,9 и t=35⁰С)

Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae в питательной среде №3, показанная на рисунке 7, позволяет увидеть, что спустя 24 часа культивирования рост бактерий достигает 3,2, а спустя 52 часа с момента культивирования уменьшается на 71%.

Рисунок 8 – Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №3 (рН 6,9 и t=35⁰С)

На графике рисунка 8 показана динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №3. Максимальный рост достигается спустя 24 часа культивирования, достигая отметки 4,5, а через 2 часа происходит снижение

Рисунок 9 – Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae штамма М-2 на питательной среде №4 (рН 6,9 и t=35⁰С)

На рисунке 9 мы видим, что спустя 24 часа после достижения максимального роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №3 рост снижается на 20%.

Рисунок 10 – Динамика роста бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae на питательной среде №5 (рН 6,9 и t=35⁰С)

На питательной среде №4 бактерии Erysipelothrix rhusiopathiae , спустя 24 часа достигают отметки 2,2, а через 4 часа рост увеличивается на 40%, достигая максимального уровня.

Таким образом, на одних и тех же средах наиболее подходящими являются параметры рН 6,9 и t=350С.

Из предложенных вариантов среда № 2, содержащая соевый концентрат обладает наибольшей продуктивностью для бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae.

В качестве альтернативных источников белкового сырья для производства питательных сред предлагаем использовать соевый концентрат, который готовят следующим образом: соевый концентрат смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 25,0 г сухих веществ, затем вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л, устанавливают рН 8,0-8,2 с помощью 1%-го раствора гидроокиси натрия.

Вывод

Для культивирования предлагаем питательную среду: соевый концентрат - 25%; печеночный экстракт - 5%; пептон – 0,5%; сухой дрожжевой экстракт 0,5%; NaCl - 0,2%; KH2 PO4 - 0,3%; Na2HPO4 - 1,8%; Твин-80 -0,05%; глюкоза - 0,2%; нормальная сыворотка крупного рогатого скота - 2%; L-аргинин - 0,05%; дистиллированная вода до 100%, обеспечивающую прирост биомассы на 12,8% выше, чем используемую в промышленности.