Исследование закономерностей биоаккумуляции меди представителями автотрофных и гетеротрофных организмов

Аккумулировать металлы способны практически все живые организмы. В ряде случаев металлы могут накапливаться организмами в значительных количествах [1], [4], [6], [13], [22]. Научно-практическая значимость исследования аккумуляции металлов организмами отмечена многими авторами [2], [3], [5], [11], [17], [18], [19], [21], [25], [26], [27], [28]. Научные данные о накоплении тяжелых металлов (ТМ) различными организмами и их адаптации к такой нагрузке служат фундаментальной основой, необходимой для интерпретации результатов биотестирования. Исследование механизмов и закономерностей биоаккумуляции металлов позволяет оценивать качество окружающей среды, находить чувствительных организмов-биоиндикаторов, разрабатывать биологические способы очистки сред от ТМ.

Целью работы было исследование биоаккумуляции меди автотрофными (Nosto c linckia) и гетеротрофными (Daphnia magna) организмами и применение полученных результатов в ин- терпретации данных биотестирования и поиске нового биосорбента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемыми организмами были культуры Nostoc linckia (Roth.) Born. et Flah № 271 из коллекции кафедры биологии растений, селекции и семеноводства, микробиологии Вятской государственной сельскохозяйственной академии (г. Киров) и Daphnia magna Straus, культивируемые в аккредитованной экоаналитической лаборатории Вятского государственного гуманитарного университета (г. Киров). В экспериментах с N. linckia использовали суспензию цианобактерий с титром 1,16 ∙ 10⁸кл/см³. Опыты с D. magna проводили по общепринятой методике: посадка 10 особей рачков (возраст не более 24 ч.) в 100 см³ тестируемой среды.

Выявление возможности использования микроорганизмов в качестве биосорбента Cu²⁺. Исследовали зависимость между накоплением меди культурой ЦБ и продолжительностью контакта организмов с раствором соли металла. Суспен-

зию культуры вносили в раствор CuSO 4 с концентрацией ионов меди Cu²⁺ 2 и 20 мг/дм³. Через 1 и 14 суток выделяли ионы меди Cu²⁺, сорбированные на поверхности клеток (десорбция раствором ЭДТА с поверхности клеток), поглощенные внутрь клетки и удерживаемые лиофильными компонентами (экстракция этанолом) и лиофобными веществами (экстракция четыреххлористым углеродом (ЧХУ)).

Исследование влияния восстановленного глутатиона на токсичность раствора CuSO 4 и накопление меди ЦБ и дафниями. Брали три типа растворов сульфата меди (с содержанием меди 1 мг/дм³) в смеси с глутатионом (GSH) в мольных соотношениях Cu:GSH, равных 1:0, 1:1 и 1:4. Токсичность растворов по отношению к ЦБ исследовали биолюминесцентным и тетразо-льно-топографическим методами [7], [8]. При биотестировании с использованием дафний руководствовались методикой, основанной на определении смертности и изменении плодовитости рачков [20].

Содержание меди в организмах после их экспозиции в различных средах определяли методом инверсионного вольтамперометрического анализа (ИВА) с помощью адаптированной нами методики определения меди на приборе марки «Эко-тест-ВА» с дисковым вращающимся электродом.

Для определения металла в биомассе организмов последние отделяли от тестируемой среды: цианобактерий – центрифугированием, дафний – отлавливанием на специальный сачок.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Адаптация метода ИВА для определения меди в цианобактериях и дафниях. Вследствие маленькой биомассы тест-организмов и небольшого в соответствии с этим содержания накопленного металла, метод определения меди должен обладать высокой чувствительностью. Таким методом является ИВА, но аттестованной методики определения меди в изучаемых нами организмах нет. За основу взята методика определения металла в природных водах [15]. Разделение соединений меди, в состав которых входит накапливаемый организмом металл, на фракции проводили по методике, предложенной С. Г. Васильевой [3]. В дафниях определяли общее содержание ме- талла, не разделяя на фракции. Этап пробопод-готовки фракций ЦБ и биомассы дафний (минерализация до влажных солей), предложенный разработчиком методики, усовершенствовали добавлением концентрированного раствора H2O2, что позволило ускорить данный этап работы.

Применимость методики определения меди в цианобактериях и дафниях проверили методом «введено-найдено» (табл. 1 и 2). Добавку вносили в пробу перед минерализацией [14].

Таблица 1

Проверка правильности количественного определения меди во фракциях цианобактерий Nostoc linckia 271

Фракция	Введено, мкг/дм3	Найдено, мкг/дм3
Экстракт ЭДТА	60,0	70,0 ± 21,0
Лиофильная фракция	10,0	9,3 ± 2,8
Лиофобная фракция	4	3,6 ± 1,1

Примечание. Количество введенной добавки брали, исходя из количества меди, определенного в каждой фракции ЦБ.

Таблица 2

Проверка правильности количественного определения меди в биомассе рачков

D. magna

Введено Cu2+, мкг/дм3	Найдено Cu2+, мкг/дм3
10	9,4 ± 2,9

Примечание. Количество введенной добавки брали, исходя из количества меди, определенного в дафниях.

Полученные данные свидетельствуют о возможности применения методики для определения меди в исследуемых объектах.

Выявление возможности использования ЦБ в качестве биосорбента ионов меди Cu²⁺. Результаты определения содержания меди (II) в различных фракциях ЦБ после экспозиции организмов с медьсодержащими растворами представлены в табл. 3.

Ионы меди Cu2+ обнаружены в лиофильной фракции уже через сутки, причем в большем количестве там, где концентрация металла в растворе была выше. Это может быть связано как с поступлением металла в клетку по градиенту концентраций, так и с нарушением токсикологических барьеров вследствие токсического эффекта меди. Концентрация Сu2+ в лиофобной

Таблица 3

Содержание меди во фракциях ЦБ после экспозиции культуры с растворами сульфата меди в течение 1 и 14 суток (Х∙10-3, мг/г ЦБ) и суммарная степень извлечения металла из раствора (%)

Концентрация ионов меди, мг/дм3	Через 1 сутки				Через 14 суток
	Спирт	ЧХУ	ЭДТА	Степень извлечения	Спирт	ЧХУ	ЭДТА	Степень извлечения
2	2,56 ± 0,13	1,05 ± 0,05	4,18 ± 0,21	1,52 ± 0,07	<<	1,47 ± 0,03	7,84 ± 0,39	1,82 ± 0,08
20	17,23 ± 0,86	2,51 ± 0,13	94,0 ± 4,7	21,87 ± 1,09	0,94 ± 0,08	2,83 ± 0,14	520,0 ± 5,1	100 ± 5

Примечание. «<<» – меньше предела обнаружения.

фракции в течение 14 суток практически не изменяется. К концу опыта резко уменьшается содержание металла в лиофильной фракции, а возрастает в той ее части, которая выделяется с поверхности клеток раствором ЭДТА. Это может указывать на выведение ионов из внутриклеточного пространства и накопление их на поверхности клеток. Это один из признаков адаптации культуры к негативному воздействию ионов меди: идет активный транспорт токсиканта из клетки.

Значения степеней извлечения меди из раствора в варианте с концентрацией ионов меди Cu²⁺ 20 мг/дм³ возрастают от 21 % в течение суток и до 100 % в течение двух недель. Такие результаты говорят о высоком сорбционном потенциале культуры Nostoc linckia 271 , что, несомненно, указывает на возможность ее применения в качестве биосорбента. При создании технологической схемы очистки среды от Сu²⁺ или изготовления активной добавки следует учесть динамику содержания меди в различных фракциях клеток, так как Сu²⁺ удерживаются компонентами различных фракций с разной силой. Например, при определенных условиях перемешивания, уровне рН, нагревании может произойти десорбция.

Влияние восстановленного глутатиона на накопление Cu организмами . На процесс биоаккумуляции металлов влияют многие факторы. В первую очередь, имеет значение биологический вид организмов. Не менее важны концентрация металла в среде обитания, а также его химическая форма. Большинство металлов являются активными комплексообразователями и в окружающей среде могут присутствовать в комплексах с органическими компонентами. Эффективностью и емкостью связывания металлов организмами можно варьировать путем проведения реакций комплексообразования, в результате которых образующиеся соединения обладают новыми свойствами, способствующими поглощению металлов. Отмечено влияние комплексообразования на накопление металлов живыми организмами [9], [10], [23], [27]. Медь обладает высокой комплексообразующей способностью, поэтому токсический эффект зависит от наличия и концентрации потенциальных лигандов. В роли такого лиганда может выступать глутатион.

Глутатион (GSH) – это уникальный пептид, содержащийся в клетках не только всех эукариотических организмов, но и многих прокариотов. Это соединение является признанным биогенным протектором внутриклеточного действия [16]. В рамках исследования нами была поставлена практическая задача – оценить экзогенное влияние глутатиона как активного биолиганда на биоаккумуляцию меди. Моделировали воздействие ионов меди в присутствии восстановленного глутатиона (GSH) на автотрофную культуру N. linckia и гетеротрофных D. magna .

При исследовании трех типов тестируемых сред, содержащих сульфат меди в смеси с глутатионом (GSH) в мольных соотношениях Cu:GSH, равных 1:0, 1:1 и 1:4 (содержание меди во всех вариантах 1 мг/дм3), выявлено, что глутатион увеличивает накопление меди в культуре ЦБ: чем выше доля глутатиона, тем больше меди обнаружено в клетках (рис. 1). В опыте с дафниями наблюдается тенденция к уменьшению содержания меди в организмах с увеличением доли глутатиона в тестируемом растворе (рис. 2).

вариант

Рис. 1. Содержание меди в клетках Nostoc linckia 271 . Варианты обозначены согласно соотношению Cu:GSH

Си        ICu-lGSH lCu-2GSH lCu-4GSH вариант

Рис. 2. Содержание меди в Daphnia magna . Варианты обозначены согласно соотношению Сu: GSN

Такие результаты объясняются тем, что клеточная мембрана ЦБ представляет собой бислой фосфолипидных молекул, ориентированных гидрофобными концами молекул внутрь бислоя, а гидрофильными наружу. Глутатион облегчает поступление в клетку меди за счет связывания ее ионов в прочный комплекс, который обладает липофильными свойствами и поэтому может быстро пересечь клеточную мембрану, в то время как сами ионы меди Cu2+ таким свойством не обладают.

Составляющей хитинового покрова D. magna является полисахарид хитозан, который содержит большое количество свободных аминогрупп, что позволяет ему связывать и прочно удерживать Cu2+. Глутатион не только снижает активную концентрацию меди в растворе, но и уменьшает ее количество на поверхности организмов, тем самым снижая накопление.

Установлено, что растворы с соотношением Cu:GSH 1:0 и 1:1 обладают острой токсичностью по отношению к дафниям, организмы погибли в течение первых суток экспозиции. Вариант 1:4 по показателям плодовитости и смертности приближается к контролю. В случае с ЦБ наблюдается сильная негативная взаимосвязь (коэффициент корреляции Пирсона составляет -0,8) между степенью накопления меди внутри клеток и жизнеспособностью культуры. Увеличение доли GSH в растворе приводит к увеличению накопления меди внутри клеток, уменьшению жизнеспособности, соответственно, результаты биотестирования с использованием ЦБ указывают на то, что растворы с большей добавкой глутатиона обладают большей токсичностью [12].

Таким образом, глутатион по отношению к дафниям обладает протекторным действием, а для ЦБ усиливает токсичность за счет усиления биодоступности меди. Явление усиления биодоступности может быть использовано для разработки цианобактериальных препаратов, насыщенных таким микроэлементом, как медь. Знания о биопротекторных свойствах позволят разрабатывать системы защиты от медных загрязнений.

ВЫВОДЫ

• 1.    Адаптирована методика определения содержания меди в природных водах методом инверсионной вольтамперометрии для определения указанного металла в биомассе цианобактерий и дафний.

• 2.    Установлен высокий биоаккумуляцион-ный потенциал цианобактерий Nostoc linckia по отношению к меди. Чем продолжительнее экспозиция культуры ЦБ с раствором сульфата меди, тем больше меди концентрируется на поверхности клеток. За 14 суток из раствора с концентрацией Cu²⁺ 20 мг/дм³ цианобактериальной суспензией было извлечено почти 100 % ионов металла. Это указывает на перспективность ЦБ Nostoc linckia как основы для создания биосорбента.

• 3.    На примере модельных водных сред, содержащих сульфат меди (II), с разной добавкой глутатиона показано, что с увеличением доли биолиганда относительно концентрации металла накопление ионов меди цианобактериями увеличивается, а дафниями – уменьшается. Модельные водные среды с минимальным содержанием глутатиона обладали острой токсичностью по отношению к дафниям, а для цианобактерий, напротив, – токсичнее оказались растворы с максимальной долей глутатиона.

* Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ МК-3964.2015.5.