Избирательная цитотоксическая активность катионных пептидов с дендримерной структурой: возможная роль нуклеолина и белка-супрессора Р53

Цель. Изучение противоопухолевой активности катионных пептидов на модельных клеточных линиях МК.

Материалы и методы. Перевиваемые клеточные линии МК человека mH 275 и mIS223 культивировали в стандартных условиях, динамику пролиферации анализировали на 1-,2-и 3-суточных культурах. Токсичность 12-ти ДП, линейных пептидов и липопептидов изучали с помощью стандартного МТТ-теста на 96-луночных планшетах (объем лунки 200 мкл) с интервалом 1, 2 и 3 суток культивирования клеток в присутствии пептида в концентрациях от 0,25 мкг/мл до 8 мкг/мл. Токсичным считали пептидный препарат, снижающий оптическую плотность в МТТ-тесте на 50% по отношению к клеткам, культивируемым без пептида. В качестве контроля использовали нормальные фибробласты перевиваемой линии Н1036, любезно предоставленные д.б.н. А. Ю. Александровой (РОНЦ им. Н. Н. Блохина).

Структуру и экспрессию гена NCL, кодирующего С23, анализировали с помощью специфичных ПЦР на матрице ДНК культивируемых клеток с последующим электрофорезом в ПААГе и ОТ ПЦР на матрице мРНК клеток, мутации онкогенов BRAF и NRAS – в ПЦР с последующим секвенированеим ампликонов; мутации гена ТР 53 – с помощью секвенирования 5, 6, 7, 8, 9 и 10-го экзонов этого гена, амплифицирован-ных на микрочипе.

Результаты. ПЦР-анализ выявил в обоих клеточных линиях МК мутации BRAF V600E (экзон 15) в сочетании с полиморфным вариантом в экзоне 3 гена NCL (pE149E, линия mH275). Известных мутаций в гене TP53 не обнаружено Анализ экспрессии C23 и р53 в клетках указанных линий МК до инкубации их с пептидами выявил повышенный в 8,5 раз по сравнению с нормальными клетками уровень экспрессии гена NCL и сниженный в 2,8 раза – уровень экспрессии ТР53.

Из 12-ти проанализированных на токсичность и противоопухолевую активность пептидов было отобрано 4 – все с дендримерной структурой, которые ингибировали клеточную пролиферацию с активацией апоптоза в концентрациях от 0,5 мкг/мл (разведение 1:64) до 4 мкг/мл (1:8), однако без видимой токсичности в МТТ-тесте для нормальных фибробластов кожи (контрольная линия). Напротив, пептиды с линейной структурой молекулы или липопептиды в аналогичных экспериментальных условиях не ингибировали клеточную пролиферацию и не индуцировали апоптоз, а в ряде случаев стимулировали жизнеспособность опухолевых клеток в модельных культурах.

Один из возможных механизмов избирательного цитотоксического действия отобранных катионных дендримеров – их взаимодействие с рецепторными молекулами С23, которые высоко экспрессированы на мембране опухолевых клеток,

XIX РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ПАТОМОРФОЛОГИЯ

а также с цитоплазматической и ядерной фракциями С23 после транспорта молекул пептида в клетки. В результате ингибируются гиперактивированный С23-зависимый сигналинг и связывание С23 с р53, что приводит к индукции апоптоза, регулируемого р53.

Поскольку в нормальных фибробластах уровень экспрессии рецепторного С23 значительно ниже, активации свободного р53 и последующей индукции апоптоза не наблюдается. Для поиска механизмов избирательной цитотоксичности исследованных катионных ДП проводится дальнейший анализ взаимодействия этих и других пептидов с белками С23 и р53 в опухолевых (МК) и в нормальных нетрансформированных клетках.

Заключение. С помощью МТТ-теста на 2-х перевиваемых линиях МК человека, несущих мутацию BRAF V600E, обнаружена специфичная цитотоксическая активность 4-х катионных пептидов с дендримерной структурой. В культуре морфологически нормальных фибробластов индуцированного этими пептидами апоптоза не выявлено.

Пептиды с линейной структурой и липопептиды в аналогичных экспериментальных условиях не ингибировали пролиферацию клеток меланомы или даже стимулировали их жизнеспособность Исследуются возможные механизмы противоопухолевой активности ДП с участием шаперона С23 и белка-супрессора опухолевого роста р53.