Изменчивость конститутивной активности этоксирезоруфин-о-деэтилазы в печени леща ( Abramis brama L.)

Введение. Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы играют основную роль в окислительной трансформации широкого спектра эндогенных и экзогенных соединений, таких как стероиды, жирные кислоты, простагландины, а также промышленные загрязнители, биоциды и т. д. (Арчаков, Карузина, 1988; Andersson, Forlin, 1993; Omura, 1999; Estabrook, 2003). Индукция ферментов семейства цитохрома Р450 в организме животных является показателем воздействия ксенобиотиков. В мировой практике каталитическая активность этих ферментов широко используется в качестве биомаркера загрязнения окружающей среды (Payne et al., 1986; Behrens, Segner, 2001; Burger, 2006). В частности, повышенная активность этоксирезоруфин-О-деэтилазы (ЭРОД) в печени рыб свидетельствует о загрязнении водной среды полициклическими ароматическими и/или полигалогенированными углеводородами (Goksoyr, Forlin, 1992; Hahn, Stegeman, 1994).

Использование ЭРОД-активности в целях оценки качества водной среды предполагает изучение конститутивной активности фермента в организме рыб (Balk et al., 1996). В строгом понимании, в

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 11-04-01168-а, № 12-05-005 72-а).

-69- естественной популяции нельзя наблюдать конститутивную ЭРОД-активность, так как индукторы этого фермента встречаются в водной среде повсеместно. В данном исследовании под конститутивной понимается ЭРОД-активность, наблюдаемая в печени рыб, не подверженных стрессовому воздействию ксенобиотиков.

Возможно, ЭРОД-активность в некоторой степени зависит от размерно-возрастных характеристик леща, поскольку они могут быть связаны со скоростью метаболизма в организме рыб, а также степенью развития у них жировой ткани, накапливающей стойкие загрязняющие вещества. Вариабельность ЭРОД-активности в годовом цикле может быть связана с нормальными физиологическими изменениями, происходящими в организме рыб. Так, во время нереста уровень ЭРОД-активности может заметно изменяться, сопровождаясь появлением значительных половых различий (Forlin, Haux, 1990; Larsen et al., 1992; Arukwe, Goksoyr, 1997).

В качестве объекта настоящего исследования выступал лещ (Abramis brama L.) Рыбинского вдхр. - массовый вид, регулярно учитываемый методом траловой съёмки (Герасимов, Новиков, 2001). Целью работы было изучение изменчивости конститутивной ЭРОД-активности в печени рыб. В задачи исследования входило измерить ферментативную активность в размерно-возрастном ряду рыб, а также определить значения показателя в преднерестовый, нерестовый и нагульный периоды.

Методика. Для изучения изменчивости ЭРОД-активности в размерно-возрастном ряду рыб отлавливали тралом в Волжском плёсе Рыбинского вдхр. в конце сентября 2012 г. Для исследования изменений ЭРОД-активности в годовом репродуктивном цикле использовался лещ, пойманный неводом в устье р. Сутки, впадающей в водохранилище. Отлов рыб проводили в конце апреля, середине мая и начале октября 2012 г., что соответствует преднерестовому, нерестовому и нагульному периодам.

Рыб, пойманных тралом, помещали в контейнеры с забортной водой и обрабатывали в лаборатории на борту исследовательского судна. Леща, отловленного неводом, пересаживали в контейнеры с речной водой и перевозили в лабораторию для отбора проб. Далее рыб механически обездвиживали, измеряли длину тела (AD) и массу порки, иссекали печень и отбирали чешую для определения возраста. Пробы печени замораживали в жидком азоте.

ЭРОД-активность определяли флюориметрическим методом в постмитохондриальном супернатанте (Whyte et al., 2000). Навеску печени гомогенизировали в фосфатном буфере (100 мМ Na2HPO4, 25

мМ КН2РО4; pH 7.4) в соотношении 1:3. Гомогенат центрифугировали с ускорением 10000 х g при 4°С в течение 30 мин. Супернатант отбирали и хранили в жидком азоте до проведения аналитической процедуры (не более недели). ЭРОД-активность измеряли в 96-луночных планшетах на спектрофлюориметре LS55 (PerkinElmer). Аликвоту супернатанта вносили в реакционную смесь, состоящую из фосфатного буфера, 4.3 мМ Р-НАДФН, 0.01 мМ 7-этоксирезоруфина. Планшеты инкубировали 10 мин при 27°С. Интенсивность флюоресценции резоруфина, образовавшегося в результате реакции, измеряли при длинах волн возбуждения/испускания - 555/585 нм. Количество полученного резоруфина вычисляли с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием коммерческого аналога резоруфина (MP Biomedicals). Содержание белка измеряли с использованием 1.08 мкМ раствора флюорескамина в ацетоне при длинах волн возбуждения/испускания — 400/460 нм (Lorenzen, Kennedy, 1993). Количество белка вычисляли на основании калибровочного графика, построенного с использованием стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина. Каждую пробу анализировали в трёх повторностях, далее работали со средними значениями. Активность фермента представлена в нмоль резоруфина, образовавшегося за 1 мин и приходящегося на 1 мг белка.

Статистический анализ результатов проводили с использованием непараметрических методов статистики, так как распределение изучаемого признака отличалось от нормального. Статистическую значимость различий между анализируемыми выборками определяли при помощи одностороннего дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса и критерия Манна-Уитни-Уилкоксона. Для выявления корреляционных зависимостей ЭРОД-активности в печени леща от длины, массы тела и возраста рыб применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение. Для определения изменчивости ЭРОД-активности в печени леща в размерно-возрастном ряду использовано 28 особей (возраст от 2+ до 10+ лет, длина 139-363 мм, масса порки 48-925 г). Полученные коэффициенты корреляции ЭРОД-активности и длины/массы/возраста рыб указывают на отсутствие статистически значимой связи переменных (г_д = -0,23; г_м = -0,25; г_в = -0,23; р>0,05). ЭРОД-активность в печени рыб в размерном и возрастном рядах представлена на рис. 1 и 2, соответственно.

Я Я

S я Ч с 3

Я

4 1

3,5 -

3 -

2,5 -

2 -

я аа я н У я

1,5 -

1 -

О

0,5 -

0 4—

Длина тела (AD), мм

Рис.

1 .

Изменчивость ЭРОД-активности в печени леща в размерном ряду рыб

3,5

2,5

1,5

я м

Я Я 3

0,5

m

о

Возраст, полных лет

Рис. 2. Изменчивость ЭРОД-активности в печени леща в возрастном ряду рыб

3 "я ч о 3 с

Для исследования изменчивости ЭРОД-активности, связанной с нерестом, использовано 52 особи леща. Размерные характеристики рыб и результаты анализа представлены в табл. 1. Наибольшая ферментативная активность в печени рыб наблюдалась в конце апреля, что соответствовало преднерестовому периоду. Во время нереста

(середина мая) ЭРОД-активность опустилась до уровня, наблюдаемого в нагульный период (начало октября).

В весенний период наблюдались половые различия изучаемого показателя (рис. 3). ЭРОД-активность самцов и самок в большей степени отличалась в преднерестовый период, но различие между выборками не было статистически значимым (критерий Колмогорова-Смирнова, р>0,05).

Таблица 1 ЭРОД-активность в печени леща в преднерестовый, нерестовый и нагульный периоды

Дата отлова	N	ЭРОД-активность, пмоль/мг/мин	AD, мм	М, г
28.04.2012	20	0,83±0,14Ь	357±5а	844±42а
15.05.2012	20	0,15±0,02а	395±4b	1085±31b
04.10.2012	12	0,18±0,06 а	359±10а	806±68а
р-величина		<0,001	<0,001	<0,001

Примечание. N - количество особей в выборке; AD - промысловая длина тела; М -масса порки. Значения приводятся в виде среднего арифметического и его стандартной ошибки; р — величины получены при проведении одностороннего дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса; буквенные индексы присвоены значениям по результатам попарного сравнения выборок с применением критерия Колмогорова-Смирнова

В естественной среде обитания лещ, будучи бентофагом, постоянно испытывает то или иное влияние загрязняющих веществ, сорбированных донными отложениями. Поэтому с возрастом в тканях рыб может происходить увеличение концентрации стойких органических загрязнителей (Monod, Keck, 1982). Накопление ксенобиотиков в организме сопровождается индукцией ЭРОД, поэтому у взрослых особей может наблюдаться более высокая активность фермента (Hugla et al., 1995; Sleiderink et al., 1995). В настоящем же исследовании не было установлено зависимости ЭРОД-активности от размерно-возрастных характеристик леща. Полученные данные указывают на то, что молодые особи в локальной группировке могут иметь более высокую ЭРОД-активность по сравнению с взрослыми рыбами. Об отсутствии связи между ЭРОД-активностью и возрастом леща также сообщается в исследовании, проведённом на рыбах из р. Эльбы (Jedamski-Grymlas et al., 1995).

Рис. 3 . ЭРОД-активность в печени леща в весенний период.

Диаграмма построена на основании средних значений параметра в печени самцов и самок леща; ^-погрешности обозначают ошибку среднего арифметического; п - количество особей в выборке

Изменения уровня ЭРОД-активности в печени рыб, связанные с репродуктивной активностью, характеризуются как межвидовыми, так и половыми различиями. Так, например, ЭРОД-активность самок палтуса (Scophthalmus maximus L.) в нерестовый период возрастала и оставалась высокой в постнерестовый период, а у самцов - значительно снижалась во время нереста и возрастала после (Arukwe, Goksoyr, 1997). У лосося (Salmo salar L.) отмечена тенденция к увеличению ЭРОД-активности в период нереста и уменьшению в постнерестовый период; при этом уровень активности фермента в печени самок может превышать таковой у самцов (Larsen et al., 1992). У леща же в соответствии с полученными данными в преднерестовый период ЭРОД-активность повышается, а во время нереста снижается до обычного уровня. Половые различия в большей степени проявляются в преднерестовый период.

Преднерестовые изменения в организме рыб связаны с синтезом половых стероидов. Так, 17|3-эстрадиол вызывает в печени интенсивный синтез вителлогенина, предшественника белков желтка ооцитов (Shapiro, 1982; Mommsen, Walsh, 1988). Многие стероиды являются естественными индукторами ЭРОД (Danielson, 2002), поэтому с увеличением содержания половых стероидных гормонов во время активного созревания гонад следовало бы ожидать повышение ЭРОД- активности в печени рыб. Однако, в ряде исследований было показано, что 17Р-эстраднол, напротив, подавляет синтез цитохрома Р450 и, соответственно, снижает ЭРОД-активность в печени рыб (Pajor et al., 1990; O’Hare et al., 1995). Поэтому на данном этапе исследования трудно объяснить наблюдаемые изменения уровня ЭРОД-активности. Можно лишь констатировать, что физиологические перестройки, происходящие в организме рыб в связи с нерестом, определяют вариабельность ферментативной активности в печени рыб в годовом репродуктивном цикле.

Заключение. В настоящем исследовании отмечено отсутствие статистически значимой связи ЭРОД-активности в печени леща и размерно-возрастных характеристик рыб. Выявлена тенденция к повышению ЭРОД-активности в преднерестовый период относительно уровня, наблюдаемого в нерестовый и нагульный периоды. Также показано, что половые различия изучаемого показателя в большей степени проявляются на преднерестовой стадии. Существующие флуктуации ЭРОД-активности в печени леща следует учитывать при планировании и проведении мониторинговых исследований с использованием этого вида рыб.

Благодарности. Автор благодарен Ю.В. Герасимову и Г.М. Чуйко за организацию полевых исследований, Д.Д. Павлову, А.А. Морозову и Т.Б. Лапировой - за помощь в сборе материала, Т.П. Крицыной - за предоставленные данные о возрасте рыб.

Юоченко В.В. Изменчивость конститутивной активности этоксирезоруфин-о-деэтилазы в печени леща (Abramis brama L.) / В.В. Юрченко // Вести. ТвГУ. Сер.: Биология и экология. 2015.№ 3. С. 69-77.