Изменение активности каталазы и пероксидаз в листьях овса посевного под влиянием отдельного и комбинированного воздействия засоления и рН-уровня корневой среды

Среди природных стрессоров засоление занимает одно из ведущих мест. По оценке FAO (Food and Agriculture Organization) засоленными являются 22% мировых земель, находящихся в сельскохозяйственном использовании [Гарифзянов, Жуков, 2013]. На протяжении долгого времени адаптацию растений к засолению рассматривали через призму регуляторных механизмов поддержания ионного и осмотического гомеостаза. Однако, как известно, повышенная концентрация NaCl приводит к окислительному стрессу, сопряженному с избыточной генерацией ак- тивных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион радикал (О2•-), перекись водорода (Н2О2) и гидроксильный радикал (•ОH) [Meneguzzo, Navani-Izzo, Izzo, 1999; Mittler, 2002; Полесская, Каширина, Алехина, 2006; Гарифзянов, Жуков, Ивани-щев, 2011]. Наряду с выполнением необходимых сигнальных или иных функций, АФК, как высокореактивные вещества, способны наносить вред биологическим структурам клетки и физиологобиохимическим процессам, протекающим в ней.

Антиоксидантная защитная система клетки растения – это множество взаимосвязанных окислительно-восстановительных реакций, в которых участвуют антиоксидантные ферменты и низкомо-

лекулярные метаболиты. В нормальных условиях и при окислительном стрессе супероксиддисмутазы, пероксидазы, каталаза и ферменты аскорбат-глутатионового цикла, играют важную роль в поддержании определенного безопасного уровня АФК. В ответ на усиление генерации АФК, как правило, наблюдается активация элементов антиоксидантной защитной системы. [Sies, 1997; Колупаев, 2007; Jones, 2008 и др.].

В почвах накопление солей может сопровождаться увеличением щелочности, техногенное засоление развивается и на фоне кислой реакции среды [Еремченко, Митракова, Шестаков, 2017]. В свою очередь, для большинства сельскохозяйственных культур, в особенности для молодых растений, требуется благоприятная среда, близкая к pH 6.5. Следовательно, актуальность изучения механизмов адаптации растений к совместному воздействию засоления и кислотности/щелочности обусловлена тем, что эти факторы сочетаются в природных и техногенных почвах. В современной физиологии растений недостаточно изучена ответная реакция растений на комбинированное воздействие этих факторов на состояние корневой среды, в том числе, участие ферментов антиоксидантной защиты в устойчивости растений.

Цель работы – изучить изменение активности каталазы и пероксидаз в листьях овса посевного под влиянием отдельного и комбинированного воздействия засоления и рН-уровня корневой среды.

Объекты и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали овес посевной Avena sativa L. Предварительно замоченные семена высаживали в вермикулит. На 7й день после посадки на корневую среду воздействовали стресс-факторами: 100 мМ NaCl, 200 мМ NaCl, pH 3, pH 10, 100 мМ NaCl + рН 3, 100 мМ NaCl + рН 10, 200 мМ NaCl + рН 3, 200 мМ NaCl + рН 10. Щелочная среда создавалась буфером глицин-KOH (pH10), кислая – уксусной кислотой. Устойчивость реакции среды в вермикулите под воздействием щелочных и кислых растворов контролировали путем измерения на рН-метре в течение 48 ч. Контрольный полив производили дистиллированной водой. Через 30 мин. после воздействия стресс-фактором определяли содержание пероксида – по ферротиоцианатному методу [Sagisaka, 1976], пероксидазную функцию в растительном материале по методу А.Н. Бояркина [Ермаков и др., 1987], активность каталазы – титрометрическим методом по А.Н. Баху и А.И. Опарину [Воскресенская, Алябышева, По-ловникова, 2006]. Биологическая и аналитическая повторность определений – трехкратная. Ростовые показатели определяли через 24 и 48 ч. в 30- кратной повторности. Полученные данные обработаны методами статистики, регрессионного и дисперсионного анализов.

Результаты и их обсуждение

Общим интегральным процессом, характеризующим негативное действие стрессоров различной природы, является усиление генерации активных форм кислорода. Пероксид водорода, обладающий наибольшим временем жизни (около 1 мс) и способный диффундировать от места образования, является одним из важнейших кислородных редуктантов, который в клеточных компартментах приводит к окислению липидов, углеводов, белков, повреждению ДНК и РНК, дезорганизации цитоскелета [Foyer, Noctor, 2005; Полесская, 2007; Pol-jsak, Milisav, 2012; Miura, Tada, 2014; Радюкина 2015].

Результаты нашего эксперимента показали, что на всех опытных вариантах после воздействия стресс-факторов наблюдалось повышенное содержание пероксида водорода в листьях овса в сравнении с контролем (рис. 1). Наибольшее количество пероксида зафиксировано при действии отдельных факторов: растворов с рН3 и рН10 и засоления NaCl 100мМ, содержание его в растениях было в 8–10 раз выше контрольного уровня. При сочетании засоления и кислотности, засоления и щелочности корневой среды, особенно растворов с NaCl 200мМ, количество перекиси было ниже опытных вариантов с действием отдельных факторов, что может быть обусловлено функционированием антиоксидантной системы.

В последнее время активно обсуждается вопрос о способности АФК выступать в качестве сигнальных молекул и регуляторов экспрессии генов, детерминирующих защитный ответ растения. Определенный уровень АФК необходим для протекания ряда метаболических реакций в клетке и не вызывает повреждений биомолекул. Образование повышенного количества АФК опасно в случае нарушения баланса их образования и разрушения. Наиболее распространенными ферментами, способными детоксифицировать пероксид, являются каталаза и большое семейство пероксидаз [Blokhina, Virolainen, Fagerstedt, 2003; Mittova et all., 2003; Apel, Hirt, 2004; Mittler et al., 2004; Gechev et al., 2006; Полесская, 2007; Abogadallah, 2010, Poljsak, Milisav, 2012; Радюкина 2015; Foyer, Noctor, 2015].

В ходе эксперимента в надземной части овса посевного при разном уровне засоления корневой среды происходило достоверное увеличение активности каталазы (на 24–33%) по сравнению с контролем (рис. 2). Увеличение активности этого фермента (на 21%) отмечено и после воздействия кислого раствора без засоления. На остальных ва- риантах опыта, сочетающих оба стрессовых фактора корневой среды, не было значимых различий с контролем по активности каталазы.

ОмМ ЮОглМ ZOOmM

концешрадй NaCl и pH кнесимеи' рас спора

Рис. 1 . Содержание перекиси в листьях овса посевного под влиянием отдельного и комбинированного воздействия засоления и рН-уровня корневой среды (черным цветом выделен контрольный вариант опыта)

О ЮОмМ 200мМ

Рис. 2 . Активность каталазы в листьях овса посевного под влиянием отдельного и комбинированного воздействия засоления и рН-уровня корневой среды (черным цветом выделен контрольный вариант опыта)

Сущность каталитического действия каталазы состоит в разложении перекиси водорода с выделением молекулярного кислорода. Данная реакция протекает с очень высокой скоростью, одна молекула фермента способна вызвать распад 6 x 10 6 молекул перекиси водорода в секунду. В то же время каталаза имеет низкое сродство к субстрату (H 2 O 2 ) и начинает работать только при достаточно высоком содержании перекиси. В связи с этим, а также, поскольку каталаза практически отсутствует в ряде компартментов клетки, существует необходимость функционирования других ферментов, задействованных в детоксикации перекиси водорода [Рогожин, 2004; Гарифзянов, Жуков, Иванищев, 2011].

Активность пероксидаз в листьях овса относительно контроля возрастала на 50–60% при действии отдельного засоления корневой среды (рис. 3). Близкое к этому усиление пероксидазной функции наблюдалось и при отдельном воздействии рН-уровня корневой среды: на 52 – на кислой и на 57% – на щелочной среде. При сочетании факторов засоления и кислотности/щелочности корневой среды существенных различий по активности пероксидаз в надземных органах овса посевного относительно контроля через 30 мин. после воздействия не обнаружено.

100мМ      200мМ

Рис. 3 . Пероксидазная функция в надземной части овса под влиянием отдельного и комбинированного воздействия засоления и рН-уровня корневой среды (черным цветом выделен контрольный вариант опыта)

Наш эксперимент подтверждает сбалансированность окислительно-восстановительных реакций в растительных клетках, т. к. были выявлены прямые зависимости между содержанием перекиси (y 1 ) и активностью каталазы (х 1 ), а также между содержанием перекиси и активностью пероксидаз (y 2 ) в листьях овса посевного (х 2 ): y 1 = 23.91+924.7х 1 ; коэффициент корреляции R=0.37; уровень значимости нулевой гипотезы P=0.0005; y 2 = 27.26 + 1565x 2 ; R=0.5; Р=1.2 х 10^-6.

Наиболее общим проявлением и первым симптомом действия стрессоров является подавление роста и развития растений. В природе степень устойчивости к действию стрессора часто характеризуется обратной корреляцией со скоростью роста. Медленный рост позволяет растениям выживать при стрессе, так как освобождает множество ресурсов (строительных блоков и энергии), необходимых для реализации защитной программы [Алехина и др., 2005; Deinlein et al., 2014].

Данные нашего исследования показали, что высота надземной части растений овса посевного через 24 ч. после воздействия растворов с разным рН-уровнем (без засоления) достоверно ниже контрольного варианта. На кислой среде прирост длины надземной части тормозится на 75% в сравнении с контролем, на щелочной – на 38% (рис. 4). Через 48 ч. после воздействия стресс-фактора существенные различия по приросту высоты надземной части наблюдаются только между контрольным вариантом и рН 3 (меньше контроля на 37%).

контроль 200мМ      200мМ+рН3      200мМ+рН10

Рис. 4 . Высота надземной части растений овса посевного при отдельном и комбинированном воздействии засоления и разных рН-уровней корневой среды

При отдельном воздействии засоления 100 мМ через 24 ч. значимых различий по приросту с контролем не обнаружено, через 48 ч. отмечено торможение на 16%. При комбинированном действии засоления 100 мМ NaCl с разными рН-уровнями корневой среды надземная часть растений так же замедляет свой рост по сравнению с контролем. Через 24 ч. после воздействия стрессового фактора наиболее сильное угнетение наблюдается на вариантах NaCl 100 мМ + рН 3 и NaCl 100 мМ + рН 10 (угнетение прироста на 64 и 61% соответственно). Через 48 ч. прирост растений на варианте NaCl 100 мМ + рН 10 тормозился на 32% относительно контроля, а на варианте NaCl 100 мМ + рН 3 – на 39%.

После комбинированного воздействия засоления корневой среды NaCl 200 мМ и разных уровней рН существенные различия отмечаются между всеми вариантами опыта и контролем. Через 24 ч. наибольшее угнетение происходило на вариантах

NaCl + рН 3 и NaCl + рН 10 (прирост надземной части меньше на 81 и 77% по сравнению с контролем соответственно). Через 48 ч. угнетение наблюдалось на всех вариантах относительно контроля: при отдельном воздействии засоления – на 45, при рН 10 – на 35, при рН 3 – на 55%.

Аналогичные результаты получены и при изучении других ростовых показателей (площади листовой пластинки и массы надземной части растений овса посевного), где через 24 ч. произошло торможение роста на всех опытных вариантах, а через 48 ч. существенные различия с контролем отмечались у вариантов с кислой корневой средой (как отдельного фактора, так и в сочетании с засолением 100 мМ). При комбинации факторов засоления NaCl 200 мМ и разных рН корневой среды значимые различия высоты растений относительно контроля наблюдались в течение 2 сут. По мнению В.И. Полонского и Н.А. Сурина [2003], чувствительность зерновых культур к кислым почвам наиболее высока в фазе проростков, что согласуется с нашими данными. Резкий сдвиг рН в ту или иную сторону оказывает вредное, а иногда и губительное действие на растение, при этом менее вреден сдвиг рН почвы в щелочную сторону. Н.А. Гаевский, Т.И. Голованова, В.М. Гольд [2012] объясняют это тем, что клетки корня растения выделяют СО 2 , а иногда и органические кислоты, которые нейтрализуют избыточную щелочность.

Заключение

Через 30 мин. после отдельного и комбинированного воздействия засоления NaCl и рН-уровня корневой среды было отмечено усиление окислительно-восстановительных реакций в листьях овса посевного. На всех опытных вариантах повысилось содержание пероксида водорода в сравнении с контролем, наибольшее его количество было одновременно зафиксировано при действии отдельных факторов: кислой (рН 3) и щелочной реакции (рН 10), а также засоления NaCl 100 мМ. Активность каталазы и пероксидаз усилились при отдельном действии всех исследуемых факторов корневой среды. На фоне комбинированного стресса в листьях растений не выявлено существенного увеличения активности этих антиоксидантных ферментов. Возможно, разбалансировка между АФК-генерирующими системами и системами антиоксидантной защиты при сочетании неблагоприятных условий корневой среды связана с недостаточным количеством времени для формирования адаптивного ответа. Не исключено и угнетение защитных механизмов растений, т.к. прирост за 24-48 ч. на этих вариантах минимален. Наибольшее негативное влияние на рост овса оказывало сочетание засоления NaCl и кислой реакции (рН 3) корневой среды.