Изменение активности пероксидазной системы при действии гипертермии и засоления NaCl

Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

На проростках гороха исследовали изменения активности и изоферментных составов пероксидазы при действии закаливающих (35°С) и повреждающих температур (40 и 45 °C) с последующим засолением NaCI. При действии закаливающих температур активность фермента в листьях и корнях уменьшалась, что сопровождалось сокращением числа анионных изопероксидаз. При повреждающих температурах активность пероксидазы значительно возрастала, что связано с увеличением числа анионных и изменением активности имеющихся катионных изоформ.

У растений имеется широкий набор изоформ пероксидазы, причем изопероксидазы представляют собой мономерные белки, которые кодируются разными генами (Hiraga et al., 2001). В то же время некоторые изоформы могут быть продуктами одного гена, возникающими в результате модификации на посттранскрипционном / посттрансляционном уровнях (Лебедева и др., 2003).

Пероксидазная система служит уникальным индикатором стрессового состояния растений, она может дать достаточную информацию о их физиологическом состоянии и быть критерием их устойчивости к различным факторам среды (Андреева, 1988; Савич, 1989; Quiroda et al, 2000).

В ответ на действие определенного стрессора устойчивость клеток повышается не только по отношению к нему, но и по отношению к повреждающим агентам другой природы. Данные о существование общих систем устойчивости к избыточному засолению и высокой температуре были получены у про- и эукариотических организмов. Было показано, что на осмотический шок клетки Е. coli отвечали повышением термотолерантности, а на действие повышенных температур реагировали повышением солеустойчивости (Шерман, 1987).

Цель работы заключалась в выяснении влияния комбинированного действия гипертермии и засоления на активность и перестройки изоферментных составов пероксидазы, выступающей в качестве адаптационного фактора повышения устойчивости растений.

Объекты и методы исследований

Исследования проводились на проростках гороха (Pisum sativum L.) сорта Сахарный.

Растения выращивали в водной культуре на смеси Прянишникова (0,5 нормы). Проростки подвергали тепловому воздействию и засолению по следующей схеме: вариант 1 - контроль (смесь Прянишникова), варианты 2, 3, 4 - тепловое воздействие температурами 35, 40, 45°С в течение Зч с последующим засолением 0,4% раствором NaCI.

Для анализа растения брали на 3-й и 10-й день после обработки в начале светлого периода суток (от 9 до 10 ч).

Изоферментный состав пероксидазы анализировали в цитоплазматической фракции листьев и корней гороха с ее предварительной очисткой путем фильтрации через сефадекс G-50 (грубый).

Разделение белков осуществлялось методом диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле в щелочной (pH 8,9) и кислой (pH 4,3) буферных системах (Маурер, 1971; Сафоновы, 1971). Локализацию изоферментов устанавливали по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) с использованием в качестве индикаторов для анионных форм красителя Sunset yellow и для катионных - метиленового зеленого.

Проявление изопероксидаз проводили с использованием в качестве субстрата бензидина по прописи Сафоновых (1971), общей пероксидазной активности с тем же субстратом по методу А.Н. Бояркина (1951).

Результаты и их обсуждение

Анализ ростовых параметров проростков гороха показал, что при действии гипертермии (35°С) и последующего засоления снижался ростингиби-рующий эффект по сравнению с засолением NaCI.

При действии повышенных температур (40, 45°С) наблюдалось снижение ростовых параметров корневой системы, хотя размеры вегетативной массы при действии 40°С не уменьшались. На основании изменений ростовых параметров температуру 35°С условно можно принять как закаливающую, а 40 и 45°С - как повреждающие.

Анализ активности пероксидазы показал, что при действии закаливающей и повреждающих температур и последующего влияния хлоридного засоления можно наблюдать различные ответные реакции (таблица).

Изменение активности пероксидазы при гипертермии и засолении (в условных единицах)

Орган растения	Вариант	Время после обработки
		3 дня	10 дней
	1	31,6 ±2,2	38,6 ±2,7
Листья	2 3	26,0 ± 1,7 48,2 ± 1,6	34,3 ±3,1 56,3 ± 4,0
	4	35,9 ± 6,2	45,4 ± 1,4
	1	118,0 ±3,8	129,4 ± 5,9
Корни	2	88,5 ± 3,2	117,2 ± 3,5
	3	148,1 ± 12,1	165,8 ±4,7
	4	192,3 ±5,0	245,6 ± 5,3

Примечание. Варианты: 1 - контроль, 2, 3, 4 - гипертермия (35, 40, 45°С) 3 ч и засоление.

При действии гипертермии 35 °C и засоления наблюдалось значительное снижение активности фермента в листьях и корнях проростков на 3-й день экспозиции и уменьшение ингибирующего эффекта у более возрастных растений. Результаты позволяют допустить, что изменение активности пероксидазы в сторону снижения в первые дни при действии закаливающей температуры отражают адаптивную перестройку обмена веществ и зависят, по-видимому, от синтеза белков de novo и, прежде всего, белков теплового шока. При образовании стресс-белков наблюдается уменьшение синтеза других полипептидов, которые образуются в норме, а в данном случае можно говорить о снижении индуцированного синтеза пероксидазных белков.

При переходе в зону повреждающих температур (40-50°С) активность пероксидазы значительно возрастала, что связано, по-видимому, с индуцированным синтезом этого защитного фермента.

Анализ ' перестроек изоферментных составов согласуется с результатами, представленными в таблице. У контрольных растений, растущих на смеси Прянишникова, на 10-й день в корнях изоформы были представлены 7 компонентами, в листьях - 9. Полиморфизм катионной группы изоферментов был выражен слабее, в корнях обнаруживалось 5 форм, в листьях - 7 (рисунок). При действии закаливающих температур и засоления перестройки наборов изоферментов были связаны с упрощением составов и интенсивностью проявления отдельных форм обеих фракций изоферментов. Гипертермия (40°С) и засоление, наоборот, стимулировали увеличение числа анионных компонентов, в спектре которых можно выделить вновь появляющиеся изоформы и перераспределе-

Изменение составов изопероксидаз листьев и корней проростков гороха на 10-й день после последовательного действия гипертермии и засоления NaCl:

1 - контроль; 2 - гипертермия 35°С и засоление; 3 - гипертермия 40°С и засоление ние активности у существующих изоферментов. Ответная реакция катионных изоформ была связана с изменением активности, которая выражалась в различной интенсивности проявления зон в гелях.

Таким образом, из полученных данных можно заключить, что реакция растений на засоление при предварительной обработке их закаливающими и повреждающими температурами имеет качественно различный характер. Следовательно, механизмы обеспечения их устойчивости, которые выражаются в изменении активности пероксидазы, неодинаковы. Первый может быть связан с синтезом стресс-белков или с фосфорилированием полипептидов протеинкиназами (Кузнецов, Рощупкин, 1994), а второй - с индуцированным синтезом ферментов, выполняющих защитные функции.