Изменение микробиома кишечника при хроническом воздействии на макроорганизм солей тяжелых металлов

Введение. Тяжелые металлы являются одними из приоритетных техногенных загрязнителей и обладают выраженным токсическим влиянием на человека. Известно их тератогенное, канцерогенное и мутагенное воздействие. Уровень концентрации, оказывающий токсическое воздействие на макроорганизм, зависит от вида металла и его биологической роли. Концентрация меди более 3 мг/л может стать причиной острого нарушения функции желудочно-кишечного тракта, вызывая тошноту, рвоту, диарею. Отравление свинцом проявляется признаками поражения центральной и периферической нервной системы, кишечника, почек. Установлено, что тяжелые металлы оказывают влияние не только на физиологическое, но и на психическое состояние человека [1, 2]. Показано, что часто они попадают в организм человека с питьевой водой [6, 8].

Токсигенный эффект, как правило, обнаруживается уже при незначительном уровне содержания солей тяжелых металлов в макроорганизме. Существует необходимость выявления токсического воздействия данных веществ на ранних его стадиях. В связи с этим чрезвычайно интересным является использование в качестве маркера, чувствительного к малым дозам токсических веществ, микробиома кишечника, представляющего собой не только консорциум самих микробов определенного биотопа, но и совокупность всех микробных генов, оказывающих влияние на среду, в которой они существуют. Роль микробиома кишечника в поддержании гомеостаза организма трудно переоценить. Это подтверждают результаты многочисленных исследований в области биологии, биохимии, экологии, медицины и токсикологии [3, 4].

Цель исследования. Изучение возможности использования микробиома кишечника экспериментальных животных в качестве чувствительного маркера токсического воздействия солей цинка, свинца и меди при длительном их поступлении в тестируемый макроорганизм.

Материалы и методы. В работе использовали четыре группы белых беспородных мышей, которые в течение 100 сут получали питьевую воду, содержащую соли тяжелых металлов в количествах, соответствующих 10 предельно допустимым концентрациям (ПДК) [7]. В каждую из групп входило по 20 животных: первая группа получала раствор сульфата меди пятиводного (10 мг/л), вторая – раствор сульфата цинка семиводного (50 мг/л), третья – раствор ацетата свинца (0,3 мг/л). Четвертую группу (контрольную) составляли интактные животные, не получавшие солей тяжелых металлов.

Через 20, 40, 60, 80, 100 сут от начала эксперимента у животных определяли наличие количественных и качественных дисбио-тических изменений микробиома кишечника [5]. Видовой состав исследовали с помощью коммерческих тест-систем фирмы Lachema (Чехия) и определителя бактерий Берджи.

Для нахождения уровня патогенности условно-патогенных представителей микробиома кишечника определяли нуклеотидные последовательности генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности, с использованием метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (PCR Real time).

Результаты и обсуждение. Наблюдение за экспериментальными животными выявило у мышей всех опытных групп проявления воздействия на макроорганизм солей тяжелых металлов начиная с 30–40-х сут. У животных отмечалось уменьшение подвижности, вялость, замедление скорости реакции, выпадение волос, нарушение пищеварения. У мышей первой группы наблюдалось достоверное отставание в росте и массе тела по сравнению с группой контроля (p<0,05), образование множественных участков некроза кожи, изъязвление носовой перегородки, конъюнктивит, часто заканчивающийся слепотой. У 40 % мышей, подвергшихся действию сульфата цинка, зарегистрирован отек яичек и образование рубцов на коже в области ануса.

Результаты исследования дисбиотиче-ских изменений микрофлоры толстой кишки мышей, получавших тяжелые металлы с питьевой водой, показали, что частота встречаемости дисбиотических изменений микробиома кишечника на протяжении всего эксперимента изменялась (табл. 1).

Таблица 1

Частота встречаемости дисбактериоза кишечника у экспериментальных животных, %

Группа животных	20-е сут	40-е сут	60-е сут	80-е сут	100-е сут
Первая (медь)	15,1±0,2*	30,3±2,1*	39,8±2,7*	69,7±3,2*	97,2±3,7*
Вторая (цинк)	10,1±1,4*	30,2±4,1*	41,7±3,6*	74,7±4,1*	96,4±4,1*
Третья (свинец)	5,2±0,2	14,9±0,8*	29,5±1,8*	49,2±3,7*	74,3±2,6*
Контрольная	5,0±0,1	5,3±0,2	5,1±0,1	5,3±0,2	5,0±0,3

Примечание. * – достоверность различия показателя по сравнению с группой контроля (р<0,05).

Первые дисбиотические сдвиги микробиоты кишечника мышей первой и второй групп происходили уже на 20-е сут: по сравнению с контролем частота встречаемости указанных изменений повысилась в три и два раза соответственно. В третьей группе данный показатель не увеличивался. К концу эксперимента (100-е сут) дисбиотические изменения микробиома кишечника отмечались практически у всех животных опытных групп, при этом были наименее выражены в третьей группе, однако превышая контрольные значения более чем в 14 раз.

Изучение плотности колонизации представителей микробиома кишечника также выявило изменения данного показателя при воздействии солей тяжелых металлов на организм мышей, наиболее выраженные к 100-му дню эксперимента (табл. 2).

Таблица 2

Вид микроорганизмов	Группа животных
	первая	вторая	третья	контроль
Bifidobacterium spp.	5,2±0,3*	6,8±0,6*	8,9±0,9	10,1±0,6
Lactobacillus spp.	4,5±0,3*	4,7±0,5 *	6,9±0,4*	8,9±0,7
Escherichia coli	7,9±0,6	8,2±0,3	8,1±0,3	8,9±0,2
Лактозонегативные	4,5±0,6*	3,8±0,9*	1,2±0,5	0,3±0,1
Гемолитические	3,2±0,3	2,8±0,3	0,9±0,1	-
Bacteroides spp.	6,5±0,1*	6,9±0,2*	7,9±0,8	9,6±0,4
Enterococcus spp.	8,8±0,4*	8,7±0,3*	6,3±0,7	6,1±0,2
Proteus spp.	3,5±0,4	2,7±0,4*	2,3±0,6*	0,8±0,1
Klebsiella spp.	3,4±0,1*	2,5±0,3*	1,7±0,3*	0,3±0,1
Staphylococcus aureus	3,3±0,2	2,5±0,3	1,4±0,1	-
S. epidermidis	1,5±0,3	1,6±0,1*	1,2±0,1	0,9±0,2
Candida spp.	3,6±0,5*	4,1±0,3*	3,7±0,3*	0,5±0,1

Примечание. * – достоверность различий показателя по сравнению с контролем (p<0,05).

Показатели плотности колонизации микробиоты кишечника мышей к 100-му дню эксперимента, lg, KOE/г

Уровень обсемененности нормофлорой ( Bifidobacterium spp ., Lactobacillus spp .) достоверно снижался (p<0,05). В первой и второй группах мышей, получавших с питьевой водой сульфат меди и сульфат цинка, к 100-м сут произошло снижение количества лактобактерий до lg 4,5±0,28 и lg 4,7±0,54 KOE/г соответственно (в контроле lg 8,30±0,37 KOE/г). Депрессия нормофлоры происходила на фоне расширения видового спектра патогенных (гемолитические и лактозонегативные Escherichia coli , Staphylococcus aureus ) и условнопатогенных видов ( Klebsiella spp ., Proteus spp ., Enterococcus spp .). Выявленные изменения у животных третьей группы были наименее выраженными.

При оценке изменений характера микробиома большое значение имеет выявление генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности условно-патогенных видов, поскольку наличие таких генов обусловлива- ет патогенный потенциал микроорганизмов. Определение нуклеотидных последовательностей генов при помощи PCR Real time выявило статистически значимое увеличение количества особей, в генотипе которых локализованы гены, экспрессирующие факторы патогенности.

Заключение. Таким образом, при воздействии на макроорганизм солей меди, цинка и свинца выявлены количественные и структурные изменения микробиома кишечника экспериментальных животных, проявляющиеся в подавлении роста нормофлоры на фоне повышения показателей частоты встречаемости и плотности колонизации представителей условно-патогенной и патогенной микробиоты. Наиболее значительные дисбиотические сдвиги отмечены у животных, получавших с питьевой водой соли меди и цинка.

Токсичные вещества, попадающие в же- лудочно-кишечный тракт, в первую очередь нарушают равновесие в сообществе населяющих его микроорганизмов, именно они принимают на себя первый удар токсиканта. Проведенные исследования показали, что длительное поступление меди и цинка с питьевой водой в концентрации 10 ПДК приводит к подавлению нормофлоры и размножению условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в составе микробиома толстого кишечника белой мыши и, как следствие, к развитию дисбактериоза. Наиболее выраженные дисбиотические изменения выявлены у животных, получавших с питьевой водой ионы меди. У них наблюдался заметный дисбаланс в ассоциациях условнопатогенной микрофлоры, снижение уровня облигатной микробиоты (бифидобактерий и лактобактерий) и появление условно-патогенных и патогенных видов микроорганизмов, отсутствующих в контроле.

Проведенными исследованиями показано статистически значимое увеличение количества особей, в генотипе которых содержатся гены, экспрессирующие факторы патогенности. Это свидетельствует о повышении патогенного потенциала кишечной микробиоты в результате хронического воздействия на макроорганизм солей тяжелых металлов.

• 1.    Бингам Ф. Т. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов / Ф. Т. Бингам, М. Коста, Э. Эйхенберг ; пер. с англ. под ред. Х. Зигель, А. Зигель. – М. : Мир, 1993. – 368 с.

• 2.    Вредные химические вещества. Неорганические соединения элементов I–IV групп / под ред. В. А. Филова. – Л. : Химия, 1988. – 512 с.

• 3.    Звягинцева Т. Д. Дисбактериоз кишечника: клиническое значение и перспективы лечения / Т. Д. Звягинцева, Е. И. Сергиенко // Экспериментальная клиническая гастроэнтерология. – 2003. – № 3. – С. 70–74.

• 4.    Новые подходы к диагностике кишечного дисбиоза у пациентов с псориатической болезнью / Н. Г. Гумаюнова [и др.] // Вестн. Российского ун-та дружбы народов. Сер. Медицина. – 2009. – № 2. – С. 93–97.

• 5.    ОСТ 91500.11.0004–2003. Дисбактериоз кишечника. Протокол ведения больных. – М. : Минздрав России, 2003. – С. 5–21.

• 6.    Оценка качества водопроводной воды г. Димитровграда / О. В. Фокеева [и др.] // Вода. Химия и экология. – 2012. – № 11. – С. 99–101.

• 7.    СанПиН 2.1.4.1074–01. Питьевая вода и водоснабжение населенных мест. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. – М. : Минздрав России, 2002. – С. 15–17.

• 8.    Содержание тяжелых металлов в воде наблюдательных скважин полигона захоронения отходов / И. В. Турецкая [и др.] // Современные наукоемкие технологии. – 2010. – № 7. – С. 75–76.

THE MODIFICATION OF THE INTESTINE MICROBIOMEAFTER CHRONIC INFLUENCE OF HEAVY METAL COMPOUNDS ON MACROORGANISM

S.V. Panteleev, O.J. Shrol, N.I. Potaturkina-Nesterova, A.S. Nesterov, A.V. Nesterova

Ulyanovsk State University