Изменение морфологических свойств дрожжей S. cerevisiae в условиях стресса

Современное понимание механизмов адаптации дрожжей и их регуляция имеют не только важное научное, но и прикладное значение, поэтому в настоящее время актуально изучение динамики стрессовых реакций и адаптации дрожжей в условиях природной среды и биотехнологических производств [1 - 3]. Основные биохимические процессы, происходящие в клетке при различного рода экологических стрессах, отражают адаптацию к конкретным экстремальным ситуациям [4, 5]. Температурная адаптация сопровождается модуляциями в изомерном составе жирных кислот и длине их цепей; изме-

нениями в микровязкости липидного бислоя и корреляцией степени ненасыщенности микровязкости полярных и нейтральных липидов [6, 7], увеличением активности антиоксидантных ферментов [8], повышением уровня трегалозы среди углеводов цитозоля [9]. В рН – адаптации важную роль играют ферменты антиоксидантной защиты [8, 10 - 12], перегруппировка и изменение содержания липидов, углеводов клеточной стенки, изменение концентрации белков митохондрий относительно белков цитоплазмы [13, 14]. В условиях солевого стресса в дрожжах S. cerevisiae происходит изменение потенциала плазматической мембраны и внутриклеточного рН; снижение объема клеток; накопление в цитозоли глицерина; увеличение гликолитических соединений [14 - 16]. Известно, что происходящие в экстремальных условиях изменения в биохимических процессах, предопределяющие жизнеспособность клеток, оказывают влияние и на морфологические характеристики дрожжей [17, 18], в том числе на свойства гигантских колоний [19]. Поэтому важным параметром, по которому можно оценивать действие стресс - факторов на физиологические особенности дрожжей, является морфология гигантских колоний. Ранее были изучены морфолого – культуральные свойства дрожжей Saccharomyces в экстремальных условиях [20, 21]. Установлен факт морфологических изменений клеток и гигантских колоний штаммов S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW-За в результате раздельного влияния рН - и осмо – стресса. Представляет ин- терес исследование морфологических особенностей гигантских колоний дрожжей в условиях одновременного действия нескольких стресс-факторов. Изучение стрессовых воздействий и механизмов регуляции метаболизма клеток в процессе адаптации необходимо для поиска экстремофильных штаммов – перспективных объектов различных биотехнологий.

Целью работы является исследование влияния различных значений рН, температуры и концентрации NaCl в среде на морфологические особенности штамма Saccharomyces cerevisiae DAW-3a.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований являлся штамм S. cerevisiae DAW-За, хранящийся в коллекции лаборатории биохимии и биотехнологии ПИБР ДНЦ РАН и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГене-тика. Штамм DAW-3a является потомком линии штамма ВКПМ Y- 503, полученного в результате лазерного воздействия в Прикаспийском институте биологических ресурсов ДНЦ РАН [22]. Принадлежность штаммов S. cerevisiae Y-503 (гетерозиготный тетраплоид) и S. cerevisiae DAW-3а (гетероталличный гаплоид) к таксону S. cerevisiae была подтверждена с помощью молекулярно-генетических методов [23].

Гигантские колонии дрожжей выращивались на твердой среде YPD, содержащей дрожжевой экстракт – 0,5 % (BD, США), пептон – 0,5 % (BD, США), глюкозу (D-глюкоза) – 2,0 % (Merk, Германия), агар-агар – 2,5 % (Difco, Нидерланды), при различных значениях температуры (30 и 37°С), pH (3,0; 4,5; 7,0; 9,0; 11,0) и концентрации NaCl (0 и 5%) в течение двадцати суток на чашках Петри. Морфология клеток колоний (форма, величина клеток, способ вегетативного размножения) изучалась с использованием светового микроскопа. Основным критерием для определения морфологического типа колоний служила совокупность стандартных признаков: формы, размеров, цвета, поверхности, профиля, края, структуры. В работе использовались приборы: ламинарный бокс ВЛ-12 1000 (Россия), микробиологический инкубатор BINDER BF 115 (Германия), сушильный шкаф SNOL 67/350 (Utenos, Литва), микроскоп CХ21 (Olympus, Япония), pH - метр Анион 4100 (Анион, Россия); весы аналитические DV215CD (Ohaus Discovery, Швейцария). Кислотность среды корректировалась 1N НС1 или 4М КОН (Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате исследования процесса адаптации DAW-3а к широкому диапазону значений рН среды при отсутствии соли и температуре 30°С обнаружены морфологические изменения гигантских колоний и образующих их клеток. Установлено, что значение рН 4,5 являлось оптимальным для роста дрожжей (таблица). Повышение или уменьшение рН среды культивирования по сравнению с оптимальными значениями этого показателя сначала снижает, а затем приостанавливает рост дрожжевых клеток. В щелочных условиях отмечалось небольшое уменьшение размеров по сравнению с рН 4,5, при культивировании на средах с низким значением pH - существенное уменьшение размеров клеток. Однако нами обнаружена способность дрожжевых клеток DAW-3а достаточно активно развиваться в неблагоприятных условиях. Исследования показали, что во всех вариантах обнаружены почкующиеся клетки (до 5%), в клетках наибольшего размера - наличие зернистой цитоплазмы, подтверждающей присутствие запасных питательных веществ; определенная часть клеток (до 3%) содержала крупную вакуоль (рис. 1, а). Известно, что от рН зависит и термоустойчивость клеток. В литературе имеются сведения об изменении содержания субстратов энергетического обмена в клетках при низкой температуре [24], увеличении размера клеток при температуре 37°С [25]; появлении множества глобулярных структур на поверхности клеточной стенки при тепловом стрессе [7]. В нашем случае в условиях повышенной температуры 37°С и при отсутствии соли обнаружена однородность формы клеток во всех вариантах и небольшое увеличение размеров при рН 3,0 по сравнению с клетками при 30°С (таблица; рис. 2, а), что, возможно, отражает уровень их устойчивости к гипертермии.

При рассмотрении морфологических свойств гигантских колоний штамма DAW-3а в широком диапазоне значений рН, отсутствии соли и показаниях температуры 30 и 37°С во всех вариантах наблюдается сохранение округлой, в виде цветка формы, радиально исчерченной поверхности, плоского, со слегка выпуклым центром профиля; незначительное изменение цвета (оттенки бежевого) и структуры (небольшое уплотнение при pH 11,0). При этом выявлено существенное изменение размеров гигантских колоний DAW-3a в зависимости от температуры и pH среды. Если при температуре 30°С значение рН 4,5 являлось оптимальным для роста колоний, то при 37°С ситуация меняется. В условиях повышенной температуры на средах с низким значением pH 3,0 размер колоний был максимальным, что коррелирует с размерами клеток и отражает адаптивный ответ DAW-3а на тепловое воздействие. Данные специфические особенности дрожжей S. cerevisiae DAW-3а представляют интерес для поиска штаммов, толерантных к кислой среде

Таблица. Влияние различных значений рН, температуры и 5% NaCl на размеры (мкм) клеток S. cerevisiae DAW-3a

з начения pH T°C, NaCl\	pH 3.0	pH 4.5	pH 7.0	pH 9.0	pH 11.0
30°С	5x5 - 10% 4x4 - 40% 3x3 -30% 2x2 - 20% единичные клетки - 10x8	8x8 - 10% 7x6 - 80 % 5x5 -10% единичные клетки -12x10; 3x3	8x7 - 10% 6x6 - 10% 6x5 -60% 4x3 - 10% единичные клетки - 10x9; 3x3	8x7 - 10% 6x6 - 10% 5x5 -50% 4x3 - 30% единичные клетки - 9x8; 3x3	7x6 - 10% 6x6 - 10% 5x5 -40% 4x3 - 30% 3x3 - 10% единичные клетки - 8x8; 3x2
30°С, 5% NaCl	4x4 - 30% 3x3 - 40% 2x2 -20% 1x1 - 10% единичные клетки - 5x5	6x5 - 10% 5x5 - 10% 4x4 -40% 3x3 - 30% 2x2 - 10%	7x6 - 10% 6x6 - 10%4x4 -50% 3x3 - 20% 2x2 - 10%	7x6 - 10% 6x6 - 10% 6x5 -10% 4x4 - 40% 3x3 - 30% единичные клетки - 8x8	7x6 - 10% 6x6 - 10% 4x4 -40% 3x3 - 30% 2x2 - 10%
37°С	5x5 - 40% 4x4 - 30% 3x3 -30%	8x8 - 10% 7x6 - 20 % 6x6 -30% 5x5 - 20% 3x3 - 20%	7x7 - 10% 6x6 - 70%4x4 - 20%	6x6 - 20% 5x5 - 50 % 3x3 -30% единичные клетки - 7x7	7x6 - 20% 6x6 - 10 % 5x5 -40% 4x4 - 10% 3x3 - 20%
37°С, 5% NaCl	5x5 - 20% 4x4 - 40% 3x3 -40% единичные клетки - 5x6	7x7 - 15% 6x6 - 20% 5x5 -35% 3x3 - 30% единичные клетки - 8x7	6x6 - 20% 5x5 - 40%4x4 -30% 3x3 - 10% единичные клетки - 7x7	6x6 - 20% 5x5 - 60% 3x3 -20% единичные клетки - 7x7	6x6 - 20% 5x5 - 40% 4x4 -20% 3x3 - 20% единичные клетки - 7x7

a )

б)

рНЗ.О рН4.5 pH 7.0        рН9.0 рНН.О

Рис. 1. Влияние рН на морфологические свойства клеток S. cerevisiae DAW-3a при 30°С в отсутствии (а) и присутствии (б) 5% NaCl

a)

рНЗ.О pH4.5

б)

рН 7 .О

рН9.О рНН.О

Рис. 2. Влияние рН на морфологические свойства клеток S. cerevisiae DAW-3a при 37°С в отсутствии (а) и присутствии (б) 5% NaCl и повышенной температуре. Известно, что высокая толерантность определенных штаммов S. cerevisiae к кислой среде является важным фактором для использования в промышленной биотехнологии [26]. В остальных вариантах дрожжи также проявили достаточную устойчивость к различным значениям рН, изменение размеров колоний варьировало в пределах 5 – 42% (рис. 3).

В целях исследования адаптации S. cerevisiae DAW-3а к солевому стрессу были изучены морфологические особенности гигантских колоний и образующих их клеток при различных значениях рН, 5% NaCl, температуре 30 и 37ºС. Обнаружено, что при температуре 30ºС в кислой среде все клетки имели округлую форму; характерно появление липидных включений; размер клеток уменьшался (таблица). Известно, что при критических значениях pH и высокой концентрации NaCl дрожжи отображают сложный набор стресс - ответов, в том числе корректировку свойств поверхности, морфогенеза, роста [27] и регулируемое изменение объема клеток [28]; клетки

pH среды

Рис. 3. Динамика изменения размеров гигантских колоний дрожжей S. cerevisiae DAW-3а в зависимости от рН и температуры

б)

рНЗ.О рН4.5 pH 7.0      р Н9.0     рНП.О

Рис. 4. Морфологические свойства гигантских колоний S. cerevisiae DAW-3а в зависимости от рН при температуре 37°С в отсутствии (а) и присутствии (б) 5% NaCl

приобретают более округлую форму [29]. В нейтральных и щелочных условиях культивирования установлена несколько большая толерантность S. cerevisiae DAW-3а к солевому стрессу по сравнению с рН 3.0; отмечались однородность и незначительное уменьшение размеров клеток (рис. 1, б), что также находит подтверждение в литературе [30]. Обнаружено наличие зернистой цитоплазмы, в отдельных клетках - крупные вакуоли; происходит накопление липидов, что, очевидно, дает возможность клетке нейтрализовать повышенное содержание соли в среде культивирования. Кроме того, одновременное воздействие нескольких критических факторов могло привести к перекрестной устойчивости [31] и повышению толерантности дрожжей DAW-3а. В условиях повышенной температуры 37°С, различных значений рН и 5% NaCl существенного изменения размеров клеток по сравнению с вариантом при 30°С не происходит (таблица). Отмечены наличие зернистой цитоплазмы во многих клетках и их однородность (рис. 2, б).

Для гигантских колоний DAW-3a в условиях солевого стресса (5% NaCl), различных значений рН и 30°С характерно уменьшение размеров, незначительное изменение цвета, формы, поверхности и структуры. Обнаружена определенная закономерность: дрожжи в вариантах с щелочным и нейтральным рН среды легче переносили солевой стресс. В результате одновременного воздействия температуры 37°С и 5% NaCl при широком диапазоне значений рН обнаружено, что штамм DAW-3a проявил устойчивость к данным экстремальным условиям. Во всех вариантах колоний сохранились форма, поверхность, профиль и структура. Выявлено изменение светло - бежевого цвета на более темный и уменьшение размеров гигантских колоний DAW-3a. Мак- симальный размер колоний отмечен при pH 11,0, минимальный - при pH 3,0 (рис. 4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, обнаружено изменение морфологических параметров клеток и гигантских колоний S. cerevisiae DAW-3а в условиях экстремальных значений температуры, pH и концентрации NaCl. Установлено, что характерной особенностью штамма являлась округлая форма клеток при всех режимах культивирования. Во всех исследованных вариантах минимальные размеры клеток отмечены в кислых средах при pH 3,0. Повышение концентрации NaCl в среде также приводило к уменьшению размера клеток; выявлено наличие зернистой цитоплазмы, липидных включений, в отдельных клетках – крупных вакуолей. Накопление запасных веществ, очевидно, способствует формированию адаптивного ответа клеток дрожжей на повышенное содержание соли в среде культивирования. Для гигантских колоний DAW-3a в условиях солевого стресса характерно уменьшение размеров, незначительное изменение контура, поверхности, цвета, профиля и структуры. При отсутствии соли и 30°С оптимальным для роста гигантских колоний дрожжей являлся рН 4,5, при 37°С - рН 3,0. В результате одновременного воздействия NaCl и температуры при широком диапазоне значений рН выявлена закономерность: дрожжи в вариантах с щелочным и нейтральным рН среды легче переносили солевой стресс. Устойчивость к экстремальным факторам имеет важное значение для исследования адаптивных способностей штамма S. cerevisiae DAW-3a с целью его возможного использования в пищевых биотехнологиях.