Изменение морфометрических показателей огурца посевного при обработке семян дельта-эндотоксином Bacillus thuringiensis

Введение. Для обеспечения высокой урожайности сельскохозяйственных культур важное значение имеет использование широкого арсенала средств, включая препараты ростостимулирующего действия.

В настоящее время применяется значительное количество препаратов для стимулирования роста и развития растений, однако большинство из них – химические (дихлор-дифенилтрихлорэтан, тиодан, дилор и др.). Их недостатком является токсичность для полезной энтомофауны и теплокровных животных [1]. Вместе с тем в последнее время появились биологические стимуляторы роста растений на основе продуктов жизнедеятельности низших грибов, актиномицетов и бактерий, такие как фитобактериомицин, трихо-тецин, биомицин, которые не только снижают поражаемость растений патогенами, но и стимулируют процессы роста и развития.

В настоящее время в сельскохозяйственной практике широко применяются биопестициды на основе споро-кристаллического комплекса и отдельных параспоральных белков (дельта-эндотоксинов) грамположитель-ной спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis . Преимуществами данных биопестицидов по сравнению с химическими средствами являются высокая специфичность действия, отсутствие загрязняющих остатков и сравнительно низкая стоимость [2, 3].

Показан антибиотический эффект дельтаэндотоксинов в отношении ряда микроорганизмов, включая бактериальные и грибные фитопатогены [4, 5]. Кроме того, отмечено ростостимулирующее влияние дельтаэндотоксина B. thuringiensis на растения [6]. Оздоровление растений, связанное с угнетением фитопатогенов, неизбежно должно привести к интенсификации обменных процессов в тканях и, как следствие, к улучшению морфометрических показателей, повышению всхожести семян и энергии их прорастания. Изучению данных закономерностей посвящена настоящая статья.

Цель исследования. Изучение влияния дельта-эндотоксина B. thuringiensis на морфометрические показатели огурца посевного.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• 1.    Проанализировать действие дельтаэндотоксина B. thuringiensis на морфометрические показатели.

• 2.    Оценить действие дельта-эндотоксина B. thuringiensis на всхожесть семян и энергию прорастания.

Материалы и методы. В работе были использованы семена огурца посевного сортов Конкурент, Журавленок и Фермер с одинаковыми морфометрическими показателями.

В качестве продуцента дельта-эндотоксина использовали B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52, полученную из ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Пущино).

Поверхностное культивирование бактерии осуществляли в термостатах при 27 ºС в чашках Петри на питательной среде РПА (рыбо-пептонный агар). Оценивали качество выращенной культуры и эффективность кристаллообразования [7].

Для получения раствора дельта-эндотоксина биомассу B. thuringiensis, содержащую кристаллы дельта-эндотоксина и споры продуцента, отмывали от водорастворимых токсинов путем центрифугирования суспензии при 3000 об/мин в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали и удаляли элементы твердой питательной среды центрифугированием при 500 об/мин в течение 5 мин. Полученный супернатант содержал бактериальные клетки, споры и кристаллы. Кристаллы отделяли от спор экстракцией в двухфазной системе: хлороформ – водный раствор Na2SO4. Водная фаза содержала кристаллы и была практически свободна от спор. Кристаллы подвергали щелочному гидролизу по методике Кукси [8]. Нерастворившийся материал осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин. Использовали свежеприготовленные растворы кристаллов. Концентрацию белкового дельта-эндотоксина оценивали по методу Лоури (МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям»).

Семена огурца предварительно дезинфицировали поверхностно 0,5 % раствором KMnO 4 (15 мин) с последующим многократным промыванием стерильной дистиллированной водой. Подготовленный таким образом материал помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу. В чашки добавляли по 10 мл раствора дельта-эндотоксина разных концентраций и инкубировали в течение 30 мин. Контролем служили семена, обработанные дистиллированной водой. Семена проращивали в термостате при температуре 27 °С. Через 17 и 25 ч инкубации учитывали количество наклюнувшихся семян и их массу.

Об интенсивности набухания семян судили по изменению массы семян в процессе проращивания. Интенсивность рассчитывали по формуле

ΔM=(Мк - Мс)/Мс·100 %, где ΔM – интенсивность набухания, %; Мк – масса семян на конец учетного периода, г; Мс – масса сухих семян, г.

Все опыты проводили в пятикратной повторности по 30 семян в каждой.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью методов математической статистики и компьютерной программы Excel 2003. Достоверность результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. В процессе исследования была проанализирована динамика всхожести семян в лабораторных условиях в первые трое суток. Согласно ГОСТ 123038-84 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести» всхожесть семян – это их способность давать за определенный срок проростки в лаборатории или всходы в полевых условиях. Спустя одни сутки замачивания в контроле в зависимости от сорта проросло 12–15 % семян, через двое суток – 45–50 % , через трое суток – 92–95 %.

Результаты исследований, представленные в табл. 1, демонстрируют достоверное увеличение относительно контроля энергии прорастания и всхожести семян сорта Конкурент через трое суток после начала замачивания при всех концентрациях дельтаэндотоксина. При концентрации 0,03 % энергия прорастания увеличилась на 3,5 %, всхожесть – на 2,1 %. Наиболее значимые изменения характерны для концентрации 0,075 %: энергия прорастания увеличилась на 5,7 %, всхожесть – на 4,2 %. Для сортов Журавленок и Фермер достоверные изменения наблюдали только для концентрации 0,075 %:

для энергии прорастания – 2,2 и 2,3 %, для всхожести – 4,3 и 3,2 % соответственно. Следует отметить, что увеличение концентрации токсина до 0,15 % не приводило к дальнейшему повышению энергии прорастания и всхожести семян всех изученных сортов. Напротив, во всех случаях наблюдали уменьшение эффекта по сравнению с более низкими концентрациями.

Для дальнейших исследований была выбрана концентрация 0,075 %, показавшая наиболее значительную эффективность.

Таблица 1

Вариант опыта		Энергия прорастания, %	Разность с контролем, %	Всхожесть, %	Разность с контролем, %
о о R S и es a H и я ©	сорт Конкурент
	Контроль	87,0±1,5	-	95,0±0,8	-
	Дельта-эндотоксин	90,0±0,6*	3,5	97,0±0,8*	2,1
	сорт Фермер
	Контроль	88,0±1,2	-	94,0±1,1	-
	Дельта-эндотоксин	89,0±1,3	1,1	96,0±0,9	2,1
	сорт Журавленок
	Контроль	90,0±1,8	-	92,0±1,0	-
	Дельта-эндотоксин	91,0±1,9	1,1	95,0±1,2	3,3
in о о R s и © а н я © Я" я	сорт Конкурент
	Контроль	87,0±1,5	-	95,0±0,8	-
	Дельта-эндотоксин	92,0±1,1*	5,7	99,0±1,7*	4,2
	сорт Фермер
	Контроль	88,0±1,2	-	94,0±1,1	-
	Дельта-эндотоксин	90,0±2,9*	2,3	97,0±3,9*	3,2
	сорт Журавленок
	Контроль	90,0±1,8	-	92,0±1,0	-
	Дельта-эндотоксин	92,0±4,7*	2,2	96,0±5,1*	4,3
^ о Я" а Я" я ©	сорт Конкурент
	Контроль	87,0±1,5	-	95,0±0,8	-
	Дельта-эндотоксин	89,0±2,4*	2,3	96,0±1,0	1,0
	сорт Фермер
	Контроль	88,0±1,2	-	94,0±1,1	-
	Дельта-эндотоксин	89,0±7,4	1,1	95,0±6,8	1,1
	сорт Журавленок
	Контроль	90,0±1,8	-	92,0±1,0	-
	Дельта-эндотоксин	91,0±8,7	1,1	93,0±9,3	1,1

Примечание. * – различия по сравнению с контролем достоверны при р < 0,05.

Влияние дельта-эндотоксина на посевные качества семян огурца

Учитывая более ранний выход из состояния покоя семян, обработанных раствором дельта-эндотоксина, можно предположить, что интенсивность прорастания связана с ускорением поступления воды в семя. Поглощение семенем воды на начальном этапе по- лучило название набухания семян [1]. При поглощении воды увеличивается объем и масса семени. В табл. 2 представлены результаты исследований, демонстрирующие влияние дельта-эндотоксина на интенсивность набухания семян.

Таблица 2

Вариант опыта	Масса семян**, г
	Через 3 ч	Через 17 ч	Разность с контролем, %	Через 25 ч	Разность с контролем, %
сорт Конкурент
Контроль	2,20±0,01	3,40±0,01	-	4,50±0,07	-
Дельта-эндотоксин	2,20±0,01	3,50±0,02*	8	4,90±0,06*	17,4
сорт Фермер
Контроль	2,20±0,02	3,30±0,03	-	4,10±0,07	-
Дельта-эндотоксин	2,20±0,01	3,30±0,03	0	4,40±0,05*	15,8
сорт Журавленок
Контроль	2,10±0,01	3,30±0,03	-	4,10±0,10	-
Дельта-эндотоксин	2,10±0,01	3,60±0,03*	25	4,70±0,07*	30

Примечание. * – различия по сравнению с контролем достоверны при р < 0,05; ** – учитывается общая масса 30 семян.

Изменение массы семян (набухание) под действием дельта-эндотоксина в концентрации 0,075 %

Отмечено выраженное стимулирование набухания семян сортов Конкурент (на 8 и 17,4 % через 17 и 25 ч соответственно) и Журавленок (25 и 30 %). В случае сорта Фермер стимулирование на 15,8 % установлено только после 25 ч замачивания.

В табл. 3 представлены результаты, показывающие изменение под влиянием дельтаэндотоксина интенсивности набухания, которая характеризует силу поглощения воды семенем.

Через 25 ч интенсивность поступления воды в семена всех сортов была значительно выше, чем через 17 ч. Дельта-эндотоксин достоверно усиливал поступление воды по сравнению с контролем на 37 % для сорта Журавленок и на 25 % для сорта Конкурент.

В случае сорта Фермер интенсивность оказалась не столь ярко выраженной, но, несмотря на это, наблюдалось достоверное увеличение показателей на 19 %.

Описанное выше влияние дельта-эндотоксина способствовало дальнейшему стимулированию развития растений (табл. 4).

Обработка семян огурца раствором дельта-эндотоксина способствовала достоверному увеличению длины проростка на 4 и 10 мм по сравнению с контролем для сорта Конкурент, на 4 и 9 мм для сорта Журавленок и на 5 и 9 мм для сорта Фермер через 3 и 7 сут соответственно. Результаты исследований показали наличие общей динамики увеличения длины проростка по всем трем сортам.

Таблица 3

Влияние дельта-эндотоксина в концентрации 0,075 % на интенсивность набухания семян

Вариант опыта	Интенсивность набухания семян**, %
	Через 17 ч	Разность с контролем, %	Через 25 ч	Разность с контролем, %
сорт Конкурент
Контроль	112,0±2,1	-	181,0±5,3	-
Дельта-эндотоксин	118,0±1,4	6	206,0±4,8*	25
сорт Фермер
Контроль	106,0±2,3	-	156,0±3,2	-
Дельта-эндотоксин	106,0±2,7	0	175,0±4,2*	19
сорт Журавленок
Контроль	106,0±2,5	-	156,0±3,6	-
Дельта-эндотоксин	125,0±4,2*	19	193,0±5,7*	37

Примечание. * – различия по сравнению с контролем достоверны при р < 0,05; ** – масса 30 сухих семян составляла 1,6±0,03 г для всех сортов.

Таблица 4

	Длина проростков, мм
	3 сут		7 сут
	Контроль	Дельта-эндотоксин	Контроль	Дельта-эндотоксин
Сорт Конкурент	15,9±2,6	20,2±2,7	43,2±4,7	53,0±4,2*
Сорт Журавленок	14,0±2,3	17,9±2,1	40,5±4,6	49,0±4,6*
Сорт Фермер	16,0±2,0	21,1±2,6	44,1±4,1	53,6±4,0*

Примечание. * – различия по сравнению с контролем достоверны при р < 0,05.

Влияние дельта-эндотоксина на длину проростков огурца

Таким образом, проведенные исследования показывают, что обработка дельта-эндотоксином приводит к значительному улучшению показателей набухания, энергии прорастания, всхожести и длины проростков. Вероятной причиной этого может являться оздоровление посевного материала за счет антибиотической активности дельта-эндотоксина в отношении фитопатогенных бактерий. Нельзя исключить также и прямое ростостимулирующее влияние на растения, однако это требует тщательной экспериментальной проверки.

Выводы:

• 1.    Отмечено увеличение массы семян за счет изменения скорости поглощения воды и увеличения интенсивности набухания семян, обработанных раствором дельта-эндотоксина в концентрации 0,075 %.

• 2.    Под действием дельта-эндотоксина значительно увеличилась энергия прорастания и всхожесть семян.

• 3.    Обработка семян огурца раствором дельта-эндотоксина привела к увеличению длины образовавшихся проростков.