Изменение профиля метилирования ДНК в тамоксифен-резистентных сублиниях клеток MCF-7

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто диагностируемым злокачественным новообразованием у женщин и основной причиной смерти женщин от онкологических заболеваний. По уровню заболеваемости за РМЖ следуют колоректальный рак и рак легких (по показателю смертности у этих двух нозологий порядок обратный) [1]. Рак молочной железы – крайне гетерогенное заболевание [2–4]. В современной литературе растет количество доказательств поликлональности канцерогенеза, описанной для большинства опухолей, за исключением миелоидных (для последних характерно моноклональное происхождение) [5, 6]. Гетерогенность опухолевых клеток частично обусловлена эпигенетическими вариациями; эпигенетическая пластичность вместе с генетическими нарушениями стимулируют опухолевую прогрессию [7].

Особую роль в развитии РМЖ имеет рецептор эстрогенов. Рецептор эстрогенов (ER) является транскрипционным фактором, который после связывания лиганда-эстрадиола, димеризации и попадания в ядро активирует транскрипцию своих генов-мишеней через эстроген-респонсивные участки в их промоторах; это классическое геномное действие сигнального каскада эстрогенового рецептора [8]. Неклассические геномные эффекты включают образование комплексов с транскрипционными факторами, ER/Sp1 и ER/AP-1, в ответ на связывание рецептора эстрогенов с лигандом [9, 10].

Антигормональные соединения, такие как антиэстроген тамоксифен, блокируют эстрогенза-висимый клеточный рост. Важную роль в развитии резистентности к тамоксифену играет активация сигнальных путей в обход рецептора, в том числе активация негативных регуляторов ERα, таких как транскрипционный фактор NF-kB, SNAIL1 и ряд других [11–13]. Особую роль как в канцерогенезе РМЖ, так и в развитии резистентности к антиэ-строгену тамоксифену играет эпигенетический контроль [14, 15], однако вопрос, каким образом эпигенетическая регуляция связана с развитием и передачей резистентности к антиэстрогенам, до сих пор во многом остается без ответа.

Целью исследования явилось изучение эпигенетических изменений и выявление паттернов метилирования при развитии гормональной резистентности клеток РМЖ.

Материал и методы

Культивирование клеток

Клетки эстрогензависимого РМЖ человека линии MCF-7 культивировали в стандартной среде DMEM, содержавшей 7 % эмбриональную сыворотку телят (FBS HyClone, США) и гентамицин (50 ед/мл) («ПанЭко», Россия), при 37 °С и 5 % СО2. При анализе скорости роста и чувствительности к тамоксифену количество клеток определяли либо при подсчете в камере Горяева, либо с использованием МТТ-теста, основанного на утилизации живыми клетками реагента МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенилте-тразол бромида). Тамоксифен-резистентная субпопуляция MCF-7/T была получена путем длительной (60 сут) селекции клеток MCF-7 в присутствии антиэстро-гена тамоксифена. После окончания селекции полученную сублинию культивировали в стандартных условиях (не более 6 мес). Субпопуляция MCF-7/R была получена при ко-культивировании клеток MCF-7 с меченными GFP клетками MCF-7/Т в течение 14 сут с последующим клонированием клеток MCF-7; контрольная сублиния MCF-7/С была получена при клонировании родительских клеток MCF-7. Сублинии MCF-7/exoТ и MCF-7/exoС были получены путем культивирования в течение 10 сут клеток MCF-7 с экзосомами клеток MCF-7/Т и MCF-7 соответственно. Сравнительный анализ чувствительности к тамоксифену в парах MCF-7/R – MCF-7/С и MCF-7/exoТ – MCF-7/exoС выявил частичную резистентность к тамоксифену клеток MCF-7/R и MCF-7/exoТ [16], что позволило в дальнейшем использовать эти линии в качестве моделей вторичной гормональной резистентности.

Выделение ДНК

При выделении геномной ДНК использовали следующий протокол:

• 1.    Клетки помещали в пробирку и добавляли 0,5 мл экстракционного буфера (10mM Tris-HCL, 2mM ЭДТА, 4mM NaCl, pH=8,0).

• 2.    Добавляли протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл.

• 3.    Инкубировали 10–16 ч при 56 °C.

• 4.    Последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенолхлороформ и хлороформом.

• 5.    К образцу добавляли 1/10 объема 5 М ацетата натрия (рН 5.3) перемешивали и осаждали ДНК 2,5 объемами холодного 96 % этанола, выдерживали образец 30 мин при температуре -70 °C.

• 6.    Пробу центрифугировали 15 мин с ускорением 12 000 g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 0,2 мл ТЕ, рН8.0.

Широкогеномное бисульфитное секвенирование XmaI-RRBS

RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) увеличивает относительную информационную ценность анализа метилирования ДНК методом NGS в сравнении с полногеномным бисульфитным секвенированием, так как каждая прочитанная последовательность RRBS включает, по меньшей мере, одну информативную последовательность CpG. В отличие от полногеномного секвенирования, библиотеки RRBS изготавливаются с использованием специфической эндонуклеазы рестрикции, которая образует пул фрагментов, богатых CpG-участками. Это значительно снижает долю генома, подвергающегося секвенированию, и обогащает его наиболее релевантными регионами [17].

Подготовка библиотек XmaI-RRBS проводилась согласно разработанному Tanas et. al. протоколу [18]. Геномная ДНК, обработанная эндонуклеазой рестрикции XmaI (Сибэнзим, Россия), была частично затуплена 5-метил-цитозинами с помощью фрагмента Кленова (3’-5’ – exo-). Частично затупленные фрагменты ДНК лигировали с синтезированными 5- метилцитозин-содержащими адаптерами. После лигирования неметилирован-ные цепи адапетера ник-транслировали путём добавления dATP, dTTP, dGTP, 5-метил-dCTP и Taq ДНК-полимеразы. Полученные фрагменты библиотеки отбирали по длине с помощью препаративного электрофореза Pippin Prep (Sage Science) в соответствии с инструкциями производителя для получения фракции 181–311 п.н. фрагментов (186–316 п.н. в случае адаптеров со штрих-кодом). Бисульфитное конвертирование элюированной фракции проводили с помощью набора Bisulfite EpiTect (Qiagen Cat # 59104). Для предотвращения неспецифического праймирования полимеразной реакции 3’-концами деградированных фрагментов ДНК фрагменты обрабатывали терминирующими нуклеотидами (ddNTP) с помощью набора SNaPshot Multiplex (Thermo Fisher Scientific, MA, USA, Cat # 4323163). Терминированные фрагменты ДНК обрабатывали РНКазой A (Sigma-Aldrich, MO, USA, Cat # 9001-99-4) и щелочной фосфатазой (SibEnzyme Cat # E328), что позволяет удалить РНК-носитель, использованный в протоколе EpiTect Bisulfite, и дефосфорилировать остаточные ddNTP соответственно. Аликвоту продукта использовали для проведения аналитической количественной ПЦР с целью определения количества циклов последующей препаративной ПЦР. Конечные библиотеки были получены с помощью ПЦР с количеством циклов, определенным для образца с помощью аналитической количественной ПЦР (обычно в диапазоне от 12 до 18 циклов). Полученные библиотеки очищали, измеряли их концентрации на флуорометре Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) и разводили до рабочей концентрации 100 пМ.

Эмульсионную ПЦР с объединенными библиотеками проводили с использованием прибора Ion OneTouch и набора Ion OneTouch 200 Template Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat # 4480974) в соответствии с инструкциями производителя. Полученные ISP были обогащены при 37 °C с использованием системы Ion OneTouch ES (Thermo Fisher Scientific). Библиотеки XmaI-RRBS секвенировали на Ion Personal Genome Machine (PGM) с использованием набора для секвенирования Ion PGM 200 и чипа Ion 318 (Thermo Fisher Scientific).

Обработка результатов секвенирования

Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программного обеспечения Ion Torrent Suite™ Software. Полученные последовательности выравнивали на полный референсный геном человека (build GRCh37/hg19) с помощью программы Bismark [19], последовательности конвертировали в варианты С>T и G>A (соответственно конверсии С>T на обратной нити), затем выравнивали на эквивалентно конвертированные варианты референсного генома и определяли лучший результат среди полученных в итоге четырех параллельных процессов выравнивания. Используемое в процессе подготовки библиотек XmaI-RRBS частичное тупление концов фрагментов ДНК, подразумевающее их достройку остатками 5-метилцитозина, создаёт артефактное метилирование 3′-концевых CpG-динуклеотидов фрагментов. Такие искусственно метилированные цитозины исключали из анализа с помощью скрипта на языке программирования Python (код опубликован нами ранее [17]). Также с помощью программы Bismark определяли уровень метилирования CpG-динуклеотидов. Дифференциально метилированными считали CpG-динуклеотиды при изменении уровня метилирования |Δ(b-value)| >0.9.

Чтобы отобрать дифференциально метилированные CpG-пары, в целом однонаправленно изменяющие уровень метилирования при развитии резистентности к тамоксифену, во всех трех парах клеточных линий, рассчитывали значение

D = (bMCF-7/Т – bMCF-7) + (bMCF-7/R – bMCF-7) – – (bMCF-7/C – bMCF-7) – (bMCF-7/exoC – bMCF-7), где b – b-value – уровень метилирования CpG-пары в клеточной линии. Отбирали CpG-пары, удовлетворяющие |D|>0.9.

Результаты

Эксперименты проводились на клетках эстро-гензависимого рака молочной железы MCF-7 и тамоксифен-резистентной сублинии MCF-7/Т, полученной в результате длительного культивирования клеток MCF-7 с тамоксифеном. Ранее мы показали возможность передачи гормональной резистентности горизонтальным путем, от резистент- ных MCF-7/Т к чувствительным клеткам MCF-7, при их совместном культивировании в условиях in vitro. Клетки с приобретенной таким образом вторичной резистентностью были клонированы и получили название MCF-7/R, клонированные контрольные клетки – MCF-7/С. При исследовании роли экзосом в подобной передаче резистентного фенотипа обнаружено, что регулярное добавление (в течение 10 сут) к родительским клеткам MCF-7 экзосом, полученным от резистентных клеток MCF-7/Т, приводит к развитию частичной резистентности клеток MCF-7 к тамоксифену (сублиния MCF-7/exoТ). В то же время экзосомы, полученные от родительских клеток MCF-7, не обладают такой активностью, и их добавление не приводит к изменению гормональной чувствительности клеток (сублиния MCF-7/exoС) [16].

Основной задачей настоящего исследования явилось изучение возможного механизма горизонтального пути распространения резистентности и дальнейшего закрепления резистентного фенотипа опухолевых клеток. В какой мере характеристики клеток с вторичной резистентностью, развившейся в результате совместного культивирования чувствительных клеток с резистентными, или при действии экзосом резистентных клеток, воспроизводят характеристики донорских резистентных клеток – для ответа на этот вопрос был проведен широкогеномный анализ метилирования ДНК в чувствительных и резистентных клетках MCF-7.

Анализ метилирования методом RRBS выявил 95 динуклеотидов CpG с дифференциальным метилированием в первой паре сублиний MCF-7 и MCF-7/T, во второй паре (MCF-7/C и MCF-7/R) обнаружен 91 дифференциально метилированный динуклеотид, а в третьей паре сублиний MCF-7/exoС и MCF-7/exoT обнаружено 23 таких динуклеотида. Сопоставление выборок выявило 19 динуклеотидов CpG, дифференциально и в целом однонаправленно метилированных при развитии резистентности к тамоксифену во всех трех парах клеточных линий. Схематическое изображение выборок представлено на рис. 1.

Для дальнейшего анализа были отобраны 19 динуклеотидов CpG с дифференциальным метилированием, обнаруженные во всех трех парах сублиний. На рис. 2 представлены значения параметра B-value, характеризующие уровень метилирования цитозинов по шкале от 1 (метилирование 100 %) до 0 (отсутствие метилирования) по каждой сублинии. Для большей части CpG (15 из 19) было отмечено повышение метилирования в резистентных сублиниях по сравнению с чувствительными. Гиперметилирование во всех резистентных сублиниях по сравнению с контрольными было отмечено в:

• 1)    межгенных участках: chr2:130344496-130344497, chr4:1040977-1040978, chr2:52799788-52799789, chr7:101361449-101361450, chr11:1858802-1858803;

  

  Рис. 1. Диаграмма Эйлера – Венна. Цифрами указано количество дифференциально метилированных CpG-пар для каждой пары клеточных линий

  
  

  метилирование (B-value)

  				g		^		g				X
  	координаты GRCh3 7/hg 19	6 S		U S		U S		U 2		U S		> S
  1	chrl:2036833-2036834		0,67		0,04		0,37		0,22		0,88		0,23
  2	chrlO:99734998-99734999		0,37		0,05		0,48		0,11		1		1
  3	chrl2:132107115-132107116		0,51		0,31		0,7		0,32		1		0
  4	chrl9:2462305-2462306		0,3		0,27		0,66		0,37		1		0,18
  5	chrlO:99734891-99734892		0,75		1		0,28		1		0,52		1
  6	chrll:1858802-1858803		0,89		0,91		0,16		0,38		0,08		0,86
  7	chrl4:102026722-102026723		0,68		0,57		0,24		0,58		0		0,62
  8	chrl5:62360801-62360802		0,54		0,72		0,2		0,4		0		0
  9	chrl7:31620119-31620120		0,56		0,54		0		0,61		0,21		0,47
  10	chrl9:56609978-56609979		0,76		0,87		0,56		0,89		0,25		1
  11	chr2:130344496-130344497		0,29		1		0,15		0,69		0,15		0,38
  12	chr2:16154295-16154296		0,35		0,96		0,43		0,48		0		1
  13	chr2:52799788-52799789		0		0,58		0,13		0,63		0		0,96
  14	chr4:1040977-1040978		0,39		0,9		0,53		1		0,25		0,42
  15	chr7:101361449-101361450		0		0,46		0		0,87		0,28		0,79
  16	chr8:141109628-141109629		0,42		0,75		0,27		0,66		0,23		0,91
  17	chr8:141109651-141109652		0,42		0,81		0,27		0,71		0,28		1
  18	chr8:141109655-141109656		0,42		0,89		0,24		0,7		0,31		1
  19	chr8:141109686-141109687		0,42		0,92		0,28		0,67		0,31		1

  
  

  Рис. 2. Уровни метилирования динуклеотидов CpG в трех парах сублиний по результатам RRBS. Приведены значения B-value для каждой координаты дифференциально метилированных CpG по 6 клеточным линиям

  
  

• 2)    внутригенных участках РНК-генов AC010145.4 (chr2:16154295-16154296), DIO3OS (chr14:102026722-102026723);

• 3)    внутригенных участках генов, кодирующих белки (по большей части в экзонах и внутригенных энхансерах, подробнее см. ниже).

Гиперметилирование отмечено в CpG генов CRTAC1 (chr10:99734891-99734892), TRAPPC9 (chr8:141109628-141109629, chr8:141109651-141109652, chr8:141109686-141109687, chr8:141109655-141109656), ASIC2 (chr17:31620119-31620120), C2CD4A (chr15:62360801-62360802), ZNF787 (chr19:56609978-56609979).

Гипометилирование во всех резистентных сублиниях по сравнению с контрольными было отмечено для 4 CpG, среди которых:

• 1)    2 CpG относятся к последовательностям белок-кодирующих генов: PRKCZ (chr1:2036833-2036834), CRTAC1 (chr10:99734998-99734999);

• 2)    РНК-ген RP11-495K9.9 (chr12:132107115-132107116);

• 3)    CpG из межгенного пространства (chr19:2462305-2462306).

На рис. 3 приведены координаты дифференциально метилированных CpG, названия генов (при наличии), к которым относятся CpG, а также направление изменения их метилирования у резистентных сублиний по сравнению с контрольными.

Обсуждение

Ранее мы показали, что ко-культивирование клеток эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 с тамоксифен-резистентными клет-

ген	координаты GRCh37/hgl9
PRKCZ	chrl: 2036833-2036834	метилирование снизилось
CRT AC 1	chrl 0:997349 98-99734999
RP1M95K9.9	chrl 2:132107115-132107116
	chrl 9:2462305-2462306
CRTAC1	chrl 0:997348 91-99734892	метилирование повысилось
	chrl 1:1858802-1858803
	chrl4:102026722-102026723
C2CD4A	chrl5:62360801-62360802
ASIC2	chr!7:31620119-31620120
ZNF787	chrl 9:56609978-56609979
	chr2:130344496-130344497
AC010145.4	chr2:16154295-16154296
	chr2:52799788-52799789
	chr4:1040977-1040 978
	chr7:101361449-101361450
TRAPPC9	chr8:141109628-141109629
TRAPPC9	chr8:141109651-141109652
TRAPPC9	chr8:141109655-141109656
TRAPPC9	chrS: 141109686-141109687

Рис. 3. Координаты дифференциально метилированных CpG в резистентных линиях и изменение их метилирования

ками MCF-7/T приводит к развитию частичной резистентности клеток MCF-7 [20]. В дальнейших исследованиях было продемонстрировано непосредственное участие экзосом в подобном горизонтальном пути распространения резистентности [16]. Для ответа на вопрос, в какой мере горизонтальный путь развития резистентности воспроизводит основные характеристики первично-резистентных клеток, был проведен анализ общего уровня метилирования ДНК в чувствительных и резистентных клетках MCF-7.

Дифференциальное изменение метилирования было обнаружено для участков ДНК, регулирующих экспрессию шести белок-кодирующих генов: PRKCZ, TRAPPC9, ASIC2, C2CD4a, ZNF787, CRTAC1. Ген CRTAC1 даже дважды попал в этот список, поскольку направление изменения метилирования у двух соседних динуклеотидов (на расстоянии 100 bp) различалось (гипо- и гиперметилирование). Общие паттерны дифференциального метилирования динуклеотидов CpG во всех шести сублиниях свидетельствуют о необходимости дальнейшего исследования потенциальной значимости этого набора генов при развитии резистентности к тамоксифену, в том числе с помощью экзосом.

Для трех генов из приведенного списка, C2CD4a, ZNF787, CRTAC1, не удалось обнаружить какой-либо возможной связи с РМЖ или с развитием каких-либо опухолей в целом. Стоит отметить, что про функцию этих генов известно довольно мало. Однако для трех других генов существуют определенные доказательства участия в регуляции опухолевой прогрессии.

Так, ген ASIC2 (acid sensing ion channel subunit 2) кодирует кислотно-чувствительный ионный канал, принадлежащий к суперсемейству дегенеринов/ эпителиальных натриевых каналов (DEG / ENaC) [21, 22]. В работе [23] была показана связь ASIC2

с развитием и метастазированием колоректального рака (CRC) за счет активации сигнального пути calcineurin/NFAT1 в условиях ацидоза [23]. По данным Protein Atlas (https://www.proteinatlas. org/ENSG00000108684-ASIC2/pathology), мРНК и белок ASIC2 определяются в линиях клеток РМЖ. За тканеспецифичную экспрессию гена ASIC2 отвечают, по данным GeneHancer, 92 энхансер-ных элемента. Координаты дифференциально метилированного динуклеотида CpG: 17:3162011931620120 относятся к дистальной части последовательности внутригенного энхансера, GH17J033292 (chr17:31619018-31620430 (GRCh37/hg19). Помимо ASIC2 данный энхансер регулирует экспрессию GC17P033138 и GC17M033432, и сам регулируется следующими транскрипционными факторами: GLIS2, ZIC2, ZBTB8A, PRDM10, CTCF, PATZ1, KLF9, ZBTB48, ZBTB26, ZFHX2, SIN3A, ZNF660, ZNF335, EGR2.

Ген PRKCZ (протеинкиназа С Zeta) кодирует атипичную потеинкиназу семейства серин/треони-новых киназ PKC, которые участвуют в различных клеточных процессах, таких как пролиферация, дифференцировка и секреция. В отличие от классических изоферментов РКС, PRKCZ имеет единственный домен типа цинковых пальцев. Функциональная активность PRKCZ включает реорганизацию микротрубочек цитоскелета, позитивную регуляцию адгезии к внеклеточному матриксу, фосфорилирование белков, участие в воспалительном ответе, в том числе NF-κB – одного из негативных регуляторов ER. CpG с дифференциальным метилированием в резистентных к тамоксифену сублиниях был обнаружен в 4-м интроне из 17 (1:2036833-2036834) и относится к последовательности внутригенного энхансера GH01J002104, контролирующего экспрессию 7 генов: помимо PRKCZ, это SKI (протоонкоген SKI), ANKRD65 (домен повторения Ankyrin 65), FAAP20

(белок 20, связанный с комплексом FA), РНК-гены ENSG00000271806 и lncRNAs GC01M002070 и GC01M002102.

Еще один дифференциально метилированный ген TRAPPC9 (Trafficking Protein Particle Complex Subunit 9) кодирует субъединицу транспортного комплекса TRAPP, являющегося одним из позитивных регуляторов NF-κB [24, 25]. Интересно, что подавление экспрессии TRAPPC9 ослабляет пролиферацию, инвазию, миграцию, образование колоний и рост ксенографтов для клеточной линии РМЖ MDA-MB-231 [25]. Участие TRAPPC9 в регуляции сигналлинга NF-κB и в онкогенезе было в дальнейшем подтверждено еще в нескольких работах [25–27].

Следует отметить, что полученные нами данные расширяют и дополняют спектр генов, метилирование которых коррелирует с развитием гормональной резистентности. Так, судя по известным литературным данным, изменения метилирования ДНК, сопровождающие развитие гормональной резистентности, представляют собой достаточно вариабельный процесс и могут охватывать широкий спектр генов в каждом отдельном случае [28, 29]. Какие из этих изменений являются ведущими, необходимыми и достаточными для развития резистентности – именно для ответа на этот вопрос было выполнено настоящее исследование на трех различных моделях резистентности, результатом которого явилась идентификация общих паттернов метилирования ДНК, ассоциированных с формированием резистентного фенотипа клеток.

Анализируя вопрос об эпигенетических факторах, участвующих в формировании гормональной резистентности, нельзя не отметить микроРНК как класс биологически активных соединений, чью роль в развитии и поддержании резистентности трудно переоценить. Среди них: mir-27, mir-181, mir-221/222, mir-21, mir-101 и ряд других, обладающих широким спектром действия, в первую