Изменение содержания гормонов гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси при росте опухоли в самостоятельном и первично-множественном варианте на фоне коморбидной патологии

Функция щитовидной железы (ЩЖ) играет центральную роль в контроле физиологических и патофизиологических процессов. Экспериментальные и клинические исследования показали, что гормоны ЩЖ модулируют клеточные процессы, связанные со старением и большинством возрастных заболеваний [1]. Продукция гормонов ЩЖ – строго регулируемый процесс, контролируемый классической петлей отрицательной обратной связи, включающей гипоталамус, гипофиз и щитовидную железу, что привело к общепринятому названию оси гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная. Рилизинг, высвобождающий тиреотропин (ТГ-рилизинг), вырабатывается в гипоталамусе. После высвобождения ТГ-рилизинг достигает гипофиза, связывается с рецептором и стимулирует выработку и секрецию тиреотропного гормона (ТТГ) [2]. В щитовидной железе ТТГ связывается с рецептором ТТГ (TSHR) и индуцирует продукцию тиреоидных гормонов (TГ). При необходимости в кровоток выделяются трийодтиронин (T3) и тетрайодтиронин (T4), также известный как тироксин.

Недавние изыскания показали, что нарушение функции ЩЖ связано с более высоким риском возникновения не только рака щитовидной железы, но и других типов рака (рак молочной железы, рак простаты), особенно в течение первых 10 лет наблюдения [3, 4]. Другое исследование установило, что женщины с субклиническим гипотиреозом, не имевшие в анамнезе заболеваний ЩЖ, подвергаются более высокому риску рака молочной железы, кожи или остеосарком [5]. В результате эпидемиологических исследований возникает множество вопросов. Нет информации о лечении, которое используется для нормализации функции ЩЖ и может повлиять на риск возникновения или прогрессирования рака [3, 6]. Немногочисленные клинические исследования и противоречивые данные литературы указывают на необходимость дальнейшего изучения и определения точного вклада нарушения регуляции ТГ в канцерогенез и прогрессирование рака. Некоторые экспериментальные исследования показывают, что гипотиреоз может вызывать повреждение клеток печени, а это, в свою очередь, является фактором риска спонтанного рака печени. Действительно, у мышей с гетерозиготным нокаутом PAX8, у которых имеется прямое нарушение в ткани ЩЖ, приводящее к умеренному гипотиреозу, частота рака печени увеличивается примерно в 3 раза [7]. Опухолевый процесс сопровождается изменением различных биологических показателей на всех иерархических уровнях организма [8]. Коморбидные заболевания оказывают влияние на развитие рака [8, 9].

Целью исследования явилось изучение уровня гормонов тиреоидной оси в гипоталамусе, гипофизе, щитовидной железе и сыворотке крови мышей при самостоятельном варианте роста меланомы В16/F10 и LLC и при сочетанном их варианте.

Материал и методы

В настоящем исследовании в качестве комор-бидной патологии выбран первичный иммунодефицит, моделью которого являются мыши Balb/c Nude. Работа выполнена на самках и самцах Balb/c Nude массой 16–18 г, полученных из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область). Все животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Работа с животными проводилась в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС), с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава России от 19.06.2003, № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Протокол экспериментального исследования был одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России от 01.09.2020, протокол этического комитета № 21/99.

Животные были разделены на группы по 7 особей: 1 – интактные; 2 – рост меланомы В16/F10, 3 – рост карциномы Льюиса (LLC), 4 – сочетанный рост меланомы и LLC. Мышам 4-й группы под кожу спины чуть ниже правой лопатки вводили 0,5 мл взвеси опухолевых клеток меланомы В16/ F10 в физиологическом растворе в разведении 1:20, с другой стороны, чуть ниже левой лопатки, подкожно вводили 0,5 мл опухолевой взвеси LLC, содержащей 0,5 млн опухолевых клеток. Животным 2-й и 3-й групп экспериментальные опухоли в самостоятельном варианте трансплантировали в том же количестве, что и в 4-й группе. Необходимо указать, что LLC в самостоятельном варианте у самцов не развивалась, но росла при сочетанном росте В16 + LLC. Животных декапитировали накануне биологической смерти: группа 2 – 26 сут; группа 3 – 28 сут; группа 4 – 22 сут. Из тканей получали 1 % гомогенаты, приготовленные на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА. В гомогенатах гипоталамуса, гипофиза, щитовидной железы, а также в сыворотке крови животных всех групп методом ИФА определяли содержание ТГ-рилизинга (Peninsula Laboratories, LLC, США), методом РИА ‒ уровень тиреотропного гормона (ТТГ), трийодтиронина (fT3) и тироксина (fT4) (Иммунотех, Чехия).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 10.0. Полученные данные подвергали анализу на соответствие распределения признаков нормальному закону распределения с использованием критерия Шапиро‒Уилка (для малых выборок). Все выборки соответствовали нормальному распределению. Сравнение количественных данных в группах (независимые выборки) проводили с использованием параметрического критерия Т-теста Стьюдента. Данные таблиц представлены в виде M ± m, где M – среднее арифметическое значение; m – стандартная ошибка среднего; за уровень статистической значимости принимали р<0,05. Полученные результаты статистически обрабатывали с соблюдением общих рекомендаций для медицинских исследований.

Результаты

Установлено, что в гипоталамусе самок мышей при всех вариантах роста опухолей происходит снижение уровня ТГ-рилизинга относительно интактных показателей: при самостоятельном росте В16/F10 – в 3,7 раза, при самостоятельном росте LLC – в 2,6 раза, а при сочетанном их росте – в 5,5 раза. При этом не обнаружено изменения уровня ТТГ в ткани гипофиза и щитовидной железы ни при одном из вариантов роста опухоли (табл. 1).

Вместе с тем, обнаружены значимые изменения в уровне тиреоидных гормонов в ткани ЩЖ. Уровень fТ3 в ЩЖ у мышей с В16 был в 3,4 раза, у мышей с LLC – в 2,3 раза, у мышей с В16/F10 + + LLC – в 2,1 раза выше показателя у интактных мышей. Выше, чем показатель в ткани щитовидной железы интактных животных, был и уровень fТ4: у мышей с В16/F10 – в 2 раза, у мышей с LLC – в 1,8 раза, у мышей с В16/F10 + LLC – в 1,75 раза.

Иное соотношение гормонов найдено в сыворотке крови. Так, ТТГ у мышей с В16/F10 был в 1,4 раза выше интактных показателей, у мышей с LLC – в 3,1 раза выше, у мышей с В16/F10 + LLC – в 1,9 раза выше показателя у интактных мышей. При этом уровень fТ3 в сыворотке крови у мышей с В16/F10 был снижен в 2,5 раза, в 2,1 раза ‒ у мышей с LLC и в 2,3 раза ‒ у мышей с В16/F10 + + LLC относительно значений у интактных животных. Уровень fТ4 был снижен в сыворотке крови животных всех исследуемых групп относительно показателя у интактных мышей: при В16/F10 – в 2,6 раза, при LLC – в 1,5 раза и при В16/F10 + + LLC – в 2,3 раза.

При оценке уровня гормонов тиреоидной оси в гипоталамусе, гипофизе, ЩЖ и сыворотке крови самцов мышей необходимо указать, что LLC в самостоятельном варианте у самцов не развивалась, но росла при сочетанном росте В16/F10 + LLC (табл. 2). При этом в гипоталамусе самцов при всех вариантах роста опухолей происходит снижение относительно интактных показателей уровня ТГ-рилизинга:

Таблица 1/table 1

Содержание факторов тиреоидной оси в гипоталамусе, гипофизе, щитовидной железе и сыворотке крови самок мышей levels of factors of thyroid axis in the hypothalamus, pituitary gland, thyroid and blood serum of female mice

Показатели/Indices	Интактные мыши/ Intact mice	Мыши с В16/ Mice with B16	Мыши с LLC/ Mice with LLC	Мыши с В16 + LLC/ Mice with В16 + LLC
Гипоталамус/Hypothalamus
ТГ-РГ, пг/г тк/	20,2 ± 2,1	5,4 ± 0,6	7,9 ± 0,9	3,7 ± 0,4
TH-releasing, pg/g of tissue		р<0,001	р<0,001	р<0,001
Гипофиз/Pituitary
ТТГ, мкМЕ/г тк/ TSH, mcIU/g of tissue	0,19 ± 0,03	0,17 ± 0,02	0,22 ± 0,04	0,19 ± 0,02
Щитовидная железа/Thyroid
ТТГ, мкМЕ/г тк/TSH, mcIU/g of tissue	1,73 ± 0,19	1,91 ± 0,24	1,64 ± 0,18	1,93 ± 0,21
fТ3, пмоль/г тк/	11,1 ± 1,3	37,7 ± 4,1	25,1 ± 2,6	23,6 ± 2,5
fТ3, pmol/g of tissue		р<0,001	р<0,001	р<0,001
fТ4, пмоль/г тк/	26,6 ± 2,8	52,4 ± 5,3	48,7 ± 4,6	46,6 ± 4,9
fТ4, pmol/g of tissue		р<0,001	р<0,01	р<0,001
Сыворотка крови/Blood serum
ТТГ, мкМЕ/мл/	0,08 ± 0,01	0,11 ± 0,01	0,25 ± 0,03	0,15 ± 0,02
TSH, mcIU/ml		р<0,01	р<0,001	р<0,001
fТ3, пмоль/л/	5,4 ± 0,6	2,2 ± 0,3	2,6 ± 0,3	2,3 ± 0,3
fТ3, pmol/l		р<0,001	р<0,001	р<0,001
fТ4, пмоль/л/	15,9 ± 1,8	6,1 ± 0,7	10,3 ± 1,2	6,8 ± 0,8
fТ4, pmol/l		р<0,001	р<0,001	р<0,001

Примечание: р – статистически значимо по отношению к показателю у интактных мышей.

Note: p – statistically significant difference compared to the values in intact mice.

Таблица 2/table 2

Содержание факторов тиреоидной оси в гипоталамусе, гипофизе, щитовидной железе и сыворотке крови самцов мышей levels of factors of thyroid axis in the hypothalamus, pituitary gland, thyroid and blood serum of male mice

Показатели/Indices	Интактные мыши/ Intact mice	Мыши с В16/ Mice with B16	Мыши с В16 + LLC/ Mice with В16 + LLC
Гипоталамус/Hypothalamus
ТГ-РГ, пг/г тк/ TH-releasing, pg/g of tissue	2,7 ± 0,3	0,63 ± 0,08 р˂0,001	0,32 ± 0,05 р˂0,001
Гипофиз/Pituitary
ТТГ, мкМЕ/г тк/ TSH, mcIU/g of tissue	0,12 ± 0,02	0,13 ± 0,02	0,34 ± 0,04 р˂0,001
Щитовидная железа/Thyroid
ТТГ, мкМЕ/г тк/ TSH, mcIU/g of tissue	1,31 ± 0,21	1,52 ± 0,18	2,01 ± 0,23 р˂0,001
fТ3, пмоль/г тк/ fТ3, pmol/g of tissue	35,5 ± 3,8	55,9 ± 5,3 р˂0,001	97,0 ± 8,6 р˂0,001
fТ4, пмоль/г тк/ fТ4, pmol/g of tissue	71,2 ± 7,4	68,8 ± 7,2	102,7 ± 9,4 р˂0,001
	Сыворотка крови/Blood	serum
ТТГ, мкМЕ/мл/ TSH, mcIU/ml	0,05 ± 0,01	0,12 ± 0,02 р˂0,001	0,11 ± 0,02 р˂0,001
fТ3, пмоль/л/ fТ3, pmol/l	5,4 ± 0,6	3,8 ± 0,5 р˂0,001	3,9 ± 0,4 р˂0,001
fТ4, пмоль/л/ fТ4, pmol/l	14,4 ± 1,6	11,9 ± 1,3 р˂0,001	11,8 ± 1,7 р˂0,001

Примечание: р – статистически значимо по отношению к показателю у интактных мышей.

Note: p – statistically significant difference compared to the values in intact mice.

при самостоятельном росте В16/F10 – в 4,3 раза, при сочетанном их росте – в 8,4 раза (табл. 2). Однако не обнаружено изменения уровня ТТГ в ткани гипофиза и щитовидной железы при самостоятельном росте В16/F10, а при сочетанном росте В16/F10 + LLC уровень ТТГ был увеличен в 2,8 и 1,5 раза соответственно.

В щитовидной железе уровень fТ3 у самцов мышей с В16/F10 был в 1,6 раза, у мышей с В16/ F10 + LLC – в 2,7 раза выше этого показателя у интактных животных. Уровень fТ4 в ткани щитовидной железы у мышей с В16/F10 не имел значимых отличий от показателя у интактных самцов, а у мышей с В16/F10 +LLC был выше в 1,4 раза.

В сыворотке крови самцов мышей с В16/F10 и В16/F10 + LLC уровень ТТГ был в 2,4 и 2,2 раза выше интактных показателей. При этом уровень fТ3 и fТ4 в сыворотке крови самцов был снижен в среднем в 1,3 раза у мышей с В16/F10 и с В16/ F10 + LLC относительно значений у интактных животных.

Обсуждение

Все больше данных указывает на то, что передача сигналов TГ при злокачественном процессе играет важную роль в пролиферации, трансформации, прогрессировании, инвазии опухоли и метастатических процессах [2]. Более того, как гипертиреоз, так и гипотиреоз связаны с развитием определенных типов диабета и рака, что указывает на сложность молекулярных механизмов, контролируемых гормонами щитовидной железы. В гипоталамусе и гипофизе ТГ действуют через ядерный рецептор ТГ β (THRβ), подавляя продукцию и секрецию ТГ-рилизинга и ТТГ, замыкая петлю отрицательной обратной связи, которая поддерживает физиологические уровни ТГ-рилизинга, ТТГ и ТГ [1].

В представленном экспериментальном исследовании выявлено нарушение физиологического каскада в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси, заключающееся в снижении уровня ТГ-рилизинга в гипоталамусе мышей при всех вариантах роста опухоли, нарушении передачи сигнала с гипоталамуса на гипофиз и с гипофиза на ЩЖ.

Одна из основных функций гипоталамуса – поддерживать гомеостаз, регулируя эндокринные и вегетативные функции организма. Рилизинг-гормон щитовидной железы, контролирующий ее гормональную секрецию, вырабатывается в паравентрикулярном ядре передней области гипоталамуса [10]. Ряд авторов предположили, что TГ-рилизинг действует как супрессор опухоли посредством ингибирования экспрессии CDK2 и циклина E и стимуляции передачи сигналов TGFβ. Эти изменения приводят к остановке клеточного цикла в фазе G1 [11]. Мутантные варианты TГ-рилизинга, такие как THRα-V390A и THRα-E350 K / P398S, действуют как доминантно-отрицательные

TГ-рилизинги дикого типа и могут уклоняться от регуляторных механизмов, способствуя прогрессированию рака [12]. Показано, что на ранней стадии онкогенного процесса происходит блокировка экспрессии рецепторов рилизинга THRα1 и THRβ1, что способствует прогрессированию рака [13]. Вмешательство в экспрессию THRβ1 способствовало росту и миграции клеток рака. Более того, подавление THRβ1 индуцирует пролиферативную способность, указывая на то, что этот рецептор является негативным фактором, способным активировать репликацию клеток, и что гипотиреоз способствует прогрессированию гепатоцеллюлярной карциномы [13].

В настоящем исследовании показано, что уровень свободных форм гормонов в щитовидной железе резко возрос, что сопровождалось увеличением уровня ТТГ в сыворотке крови и, как следствие, снижением уровня fТ3 и fТ4.

Экспериментальные исследования с использованием модели гипотиреоза на крысах показали, что гипотиреоз влияет на митохондрии печени, в которых замедляется митохондриальное дыхание и снижается способность митохондрий «удалять» перекись водорода. Если антиоксидантные реакции не способны восстановить клеточный гомеостаз, то повышенное образование активных форм кислорода (АФК) приводит к накоплению окислительного повреждения макромолекул, включая липиды, белки и ДНК [14]. АФК вызывают разрывы в ДНК, которые, если их не восстановить, способствуют канцерогенным процессам в чувствительных клетках. Известно, что T3 увеличивает уровень 8-оксо-2’-дезоксигуанозина (8-OH-dG), биомаркера окислительного повреждения ДНК. Подтверждая роль индуцированного TГ окислительного стресса, ведущего к повреждению ДНК, лечение антиоксидантами с использованием N- ацетил-1-цистеина в образцах, обработанных TГ, уменьшало образование 8-OH-dG [15]. Некоторые исследования с использованием экспериментальных моделей рака на бестимусных мышах показали, что системный гипотиреоз замедляет рост опухоли, но усиливает метастатические процессы, которые не зависят от экспрессии THRβ1 [16]. На модели гипотиреоидных мышей с использованием человеческих ксенотрансплантатов рака молочной железы и гепатокарциномы было показано возникновение большего количества спонтанных метастазов в тканях, таких как легкие, печень или кости, по сравнению с эутиреоидной патологией [16].

Заключение

Полученные результаты указывают на то, что у животных со злокачественным процессом имеет место гипоталамическая дисфункция, выражающаяся, помимо отсутствия регуляции в связи гипоталамус-гипофиз-щитовидная железа, еще и гипотиреоидным состоянием животных. Необхо- димы дальнейшие исследования для повышения уровня знаний об изменениях, которые происходят на ранних стадиях рака, связанных с ТГ, что в настоящее время ограничивает идентификацию