Изменение содержания HSP70 в байкальских эндемических губках Lubomirskiidae в условиях гипертермии

У губок экспрессия БТШ70 может быть вызвана тепловым или осмотическим шоком, рН стрессом, тяжелыми металлами и фенолами (Schröder et al., 1999, 2006). Динамика БТШ70 у морских губок изучалась в связи с проблемами теплового стресса вызванного глобальным потеплением (Lopez-Legentil et al., 2008; Webster et al., 2013). Была показана связь нескольких случаев массовой гибели губок с повышением температуры, что определяется узкими границами их температурного оптимума (Vicente, 1989; Cerrano et al., 2000; Cebrian et al., 2011; Webster et al., 2013). В геммулах пресноводной губки Spongilla lacustris было обнаружено повышенное содержание БТШ70, что позволяет клеткам стабилизировать белки и мембраны при изменениях температуры среды (Shill et al., 2006). В первом мониторинговом исследовании биомаркеров стресса было показано, что БТШ70 экспрессируется у эндемичных байкальских губок при тепловом и химическом стрессе (Efremova et al., 2002; Schröder et al., 2006). Проведенные ранее исследования показали также, что сточные воды Байкальского целлюлозно-бумажного комбината вызывают у байкальских губок повышенную экспрессию БТШ70 (Efremova et al., 2002; Schröder et al., 2006), однако данные о температурном оптимуме Lubomirskiidae отсутствуют. В свете последних экологических изменений экосистемы озера Байкал, количественная оценка стресс-индуцируемых белков необходима, чтобы идентифицировать ранние биомаркеры стресса.

Целью работы являлось изучение особенностей изменения содержания белков теплового шока семейства БТШ70 у трех эндемичных видов байкальских губок: Baikalospongia bacillifera (Dybowski, 1880), B. intermedia (Dybowski, 1880) и Swartschewskia papyracea (Dybowski, 1880) в условиях гипертермии.

MATERIALS AND METHODS

Губки были собраны в Южном Байкале (п. Листвянка) на глубине 15 метров в июле 2014 года (рис.1). Сразу после доставки в лабораторию образцы были помещены в аквариумы с байкальской водой (10 л) и содержались при температуре 4 °С и 12 часовом световом режиме, постоянной аэрации и ежедневной замене одной трети воды. Видовая идентификация образцов была проведена на основе микроскопического анализа спикул и скелета согласно ранее описанным методикам (Efremova, 2001). Температура стрессирования была выбрана на основе данных об изменении жирнокислотного состава у Lubomirskia baicalensis после культивирования в аквариуме при повышенных температурах (Glyzina, Glyzin, 2014). После периода адаптации губки были помещены в аквариумы с температурой 13 °С на 3 и 7 суток. Для S. papyracea пробы после трех суток экспозиции не фиксировали из-за мелких размеров губок. По окончании времени экспозиции образцы были помещены в кельвинатор (-70 °С).

Общий белок выделяли по ранее описанному методу (Voinikov et al., 1986). Концентрацию белка в пробах определяли с помощью Quant-iT™ Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). По 30 мкг белка каждой пробы разделяли электрофоретически в 12% SDS-PAGE (Laemmli, 1970), далее белок переносили на нитроцеллюлозную мембрану в системе mini– Protean III (Bio–Rad, USA) по прилагаемой инструкции. БТШ70 детектировали с помощью антител, как было описано ранее (Timmons, Dunbar, 1990). Использовали первичные антитела против Hsp70 (Cat. No H5147 Sigma, USA). Антитела визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Sigma, USA). Интенсивность окрашивания пятен определяли с помощью программы Gel Analysis (Россия) (усл. ед) и выражали как процент от интенсивности окрашивания пятна данного белка в контроле (или в первом образце на рисунках). Для сравнения интенсивности окрашивания пятен использовали не менее трех типичных мембран для каждого варианта опыта. Приведены средние значения суммарной интенсивности пятна и их стандартные отклонения.

RESULTS AND DISCUSSION

При анализе уровня конститутивного синтеза БТШ70 в пробах трех видов губок при 4 °С выявлены значимые различия между видами (рис.1). Наибольший уровень БТШ70 выявлен у B. intermedia, более низкий у B. bacillifera (68% по сравнению с B. intermedia), самый низкий уровень синтеза белка выявлен у S. papyracea (39% по сравнению с B. intermedia) (рис.2). Межвидовая вариабельность по содержанию конститутивного БТШ70 описана для многих морских и пресноводных организмов (Henkel et al., 2009; Garbuz et al., 2011), в частности для организмов Байкала (Timofeyev et al., 2009; Bedulina et al., 2013). Уровень конститутивного синтеза БТШ70 связан с резистентными способностями вида. Так, у термочувствительных видов амфипод уровни конститутивного синтеза БТШ70 в несколько раз снижены по сравнению с термоустойчивыми видами (Timofeyev et al., 2009; Bedulina et al., 2013). Уровень конститутивного синтеза БТШ70 определяет различия в механизмах стрессового ответа, что и было выявлено нами при анализе динамики изменений количества белка у губок после стрессового воздействия повышенной температурой 13 °С.

После экспозиции при температуре 13 °С в течение 3 и 7 суток были отмечены разнонаправленные изменения в количестве БТШ70 у трех проанализированных видов Lubomirskiidae. После трех суток экспозиции при 13 °С уровень белка у B. intermedia остался практически на прежнем уровне (97% по сравнению с контролем при 4 °С), в то время как у B. bacillifera количество БТШ70 уменьшилось в два раза по сравнению с количеством белка при 4 °С. Через семь суток экспозиции при гипертермии уровень БТШ70 у B. intermedia незначительно снизился (до 91% от контроля), тогда как у B. bacillifera остался почти на том же уровне, как и после трех суток экспозиции (37% по сравнению с контролем при 4 °С) (рис.2). Выявленное значимое снижение содержания БТШ70 у B. bacillifera при повышении температуры до 13 °С, сохраняющееся на протяжении 7 суток, может указывать на угнетение метаболизма, деградацию стрессовых белков, а также переключение с аэробного на менее эффективный анаэробный метаболизм (Geret et al., 2002 ; Sokolova, Pörtner, 2003; Axenov-Gribanov et al., 2012). В отличие от представителей рода Baikalospongia у S. papyracea выявлена тенденция к повышению уровня синтезируемого БТШ70 (на 15% по сравнению с контролем). Функциональной причиной увеличения количества БТШ70 у S. papyracea, вероятно, является необходимость компенсации стрессового воздействия, вызванного повышением температуры выше оптимальных для данного вида значений. Ефремовой с соавторами было показано, что повышение температуры окружающей среды до 20 °С вызывает увеличение количества БТШ70 у трех видов байкальских губок включая B. intermedia (Efremova et al., 2002), однако данные о температурном оптимуме Lubomirskiidae отсутствуют. Согласно нашим данным, повышение температуры окружающей среды до 13 °С может вызывать изменения в содержании БТШ70 и возможно влияет на стабильность других показателей клеточного метаболизма у Lubomirskiidae. Этот факт указывает на возможную связь зафиксированного явления обесцвечивания (Kaluzhnaya, Itskovich, 2015) и массовой гибели байкальских губок в последние годы с повышением среднегодовых температур. Известно, что морские губки имеют узкий температурный оптимум, при этом была показана связь нескольких случаев массовой гибели губок с климатическими синдромом обесцвечивания представителей различных видов Lubomirskiidae (Itskovich et al., изменениями (Vicente, 1989; Cerrano et al., 2000;

unpubl.), возможно, также связана с межвидовыми

Cebrian et al ., 2011; Webster et al. , 2013).

различиями в их терморезистентности.

Выявленная избирательная поражаемость

Figure 1. Губки Baikalospongia intermedia и papyracea .

Lubomirskiidae. a- bacillifera , b-B. c- Swartschewskia

Особенности механизмов стресс-регуляции у разных видов, как правило, коррелируют с температурными условиями существования вида. Однако исследованные нами виды обитают в сходном температурном, но различном световом режимах. Виды B. bacillifera, B. intermedia и S. papyracea населяют литоральную и сублиторальную зоны на глубинах от 1,5 до 400 метров (Efremova, 2001). Температура глубинных вод Байкала постоянна и составляет около 4 °С, в то время как в зоне верхней литорали (до 20 м глубины) возможны сезонные и суточные повышения температуры до 14-20 °С (Kozhova, Izmest’eva, 1998). S. papyracea имеет отличие в световом режиме среды обитания от B. bacillifera и B. intermedia, поскольку населяет отрицательные склоны скал и камней. Вследствие недостатка света S. papyracea всегда имеет светлую окраску из-за отсутствия симбиоза с фотосинтезирующими микроорганизмами, в то время как виды Baikalospongia на глубинах, доступных свету, имеют зеленую окраску. Влияние симбиотического состава на стресс-устойчивость губок требует дополнительных исследований.

Figure 2. Изменение уровня белка БТШ70 у байкальских губок после экспозиции при повышенной

температуре среды (13 °С) в течение 3 и 7 суток. B.bac.- Baikalospongia bacillifera , B.int .-B. intermedia , S.pap.- Swartschewskia papyracea .

Выявленное несоответствие морфологических и молекулярных данных делает актуальной проблему определения границ видов внутри Lubomirskiidae (Itskovich et al., 2008). Наиболее перспективным подходом на сегодня является интегративная таксономия, использующая все имеющиеся наборы морфологических, молекулярных, биохимических и экологических данных. Молекулярный анализ на сегодня не поддерживает монофилетичность B.bacillifera и B. intermedia (Itskovich et al., 2015). Однако выявленные нами различия в механизмах стресс-адаптации, вероятно, свидетельствуют в поддержку их видового статуса.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена в рамках госбюджетной темы № VI.50.1.4. «Молекулярная экология и эволюция живых систем Центральной Азии на примере рыб, губок и ассоциированной с ними микрофлоры» при частичной поддержке грантов РФФИ № 14-04-00838А, 14-44-04165р_сибирь_а (совместного с правительством Иркутской области).