Изменение содержания оксида азота в корнях проростков пшеницы под влиянием лектинов азоспирилл

Известно, что при взаимодействии растений с микроорганизмами происходит изменение уровня активных форм азота в растении (Глянько и др., 2009). Особую роль при этом играет оксид азота (NO). Установлено, что NO вовлечен во многие метаболические процессы в растениях: в формирование корней (Molina-Favero et all, 2007), адаптацию и ответ на стрессовые воздействия (Valderrama et all, 2007), в защитные реакции (Hong et all, 2008) и другие физиологические процессы (Beligni et all, 2000).

Исследователями молекулярных механизмов функционирования микробно-растительных ассоциаций ведется активный поиск рецепторных структур микро- и макропартнеров и изучение ответных реакций, возникающих при установлении ассоциативных взаимодействий. В ассоциации «пшеница- Azospirillum » большой интерес представляют бактериальные лектины в связи с их известными информационными функциями в различных биологических системах (Hebert, 2000). Было показано, что лектины азоспирилл за счет способности связывать углеводы, участвуют не только в адгезии бактерий на корнях растений, но стимулируют прорастание семян, проявляют по отношению к растительной клетке митотическую и ферментмодифицирующую активности (Никитина и др., 1996; Никитина и др., 2004; Alen’kina et all , 2006). Лектины способны участвовать в сигнальных процессах растений, оказывая влияние на синтез цАМФ, перекиси водорода (Аленькина и др., 2010). Данные же о влиянии лектинов азоспирилл на синтез оксида азота полностью отсутствуют.

Исследование биохимических механизмов на начальных этапах взаимодействия пшеницы с почвенными микроорганизмами имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Изучение активных форм азота на начальных стадиях формирования ассоциации между азоспириллами и пшеницей позволит углубить знания о физиолого-биохимических механизмах этого взаимодействия и повысить его эффективность в практическом аспекте.

В связи с этим, целью изучения явилась оценка изменения содержания оксида азота в корнях проростков пшеницы под влиянием лектинов двух штаммов азоспирилл - A. brasilense Sp7 и Sp7.2.3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы лектины двух штаммов Azospirillum brasilense Sp7, полученного из Института микробиологии РАН (г. Москва) и его мутанта, дефектного по лектиновой активности - Azospirillum brasilense Sp7.2.3. (Аленькина и др. , 1998).

Культуры азоспирилл выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции при 37°С в течение 18 ч (Sadasivan et all, 1985).

Выделение лектинов с поверхности клеток проводили методом Eshdat и Sharon (Echdat et all, 1978).

В экспериментах использовали кристаллические препараты лектинов, полученные после двукратного осаждения сульфатом аммония и спирто-ацетоновой смесью.

Белок определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

В работе использовали 3-суточные проростки пшеницы ( Triticum aestivum) сорта Саратовская 29. Семена стерилизовали 1 мин 60%-ным этанолом и проращивали на дистиллированной воде при 22°С. Корни выдерживали в растворах лектинов дикого и мутантного штаммов; в отдельной серии экспериментов – растворах лектинов, содержащих 1мМ СаСl 2 . Корни проростков фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали. К гомогенату добавляли по

¹²⁹                            Azospirillum lectin –

100 мкл реактива Гриесса, состоящего из равных объемов 0,3% сульфаниловой кислоты и 0,5% α-нафтиламина (Чибисова, 1999).

После 10 мин контакта определялась оптическая плотность при 540 нм. В качестве контроля использовали образцы корней, не обработанных лектинами.

Количество цитруллина определяли с помощью тонкослойной хроматографии. Экстракт подвергали ТСХ на силикагеле 60А (“Merck”, Germany) в системе растворителей, содержащей н-бутанол, уксусную кислоту и воду (4:1:1 по объему). Хроматограммы окрашивали раствором нингидрина (Дарбре 1989). Пятна вырезали, элюировали и проводили количественное определение цитруллина при 570 нм.

Полученные результаты подвергали статистической обработке (Рокицкий, 1973). Результаты представлены как средние значения трех повторностей ± стандартное отклонение. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

■лектин A. brasilense Sp7йлектин A. brasilense Sp7.2.3

Рисунок 1. Содержание оксида азота (NO) в корнях проростков пшеницы после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3.

Рисунок 2. Содержание цитруллина в корнях проростков пшеницы после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3.

Рисунок 3. Содержание цитруллина в корнях проростков пшеницы после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3 и СаСl 2 .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характер изменения уровня оксида азота в результате инкубации корней проростков пшеницы с препаратами лектинов родительского и мутантного штаммов в концентрации 40 мкг/мл был неодинаков и зависел от времени воздействия. Для обоих лектинов первое увеличение уровня оксида азота (NO) в корнях происходило уже после 1 ч воздействия лектинов и достигало максимума через 3 ч. Оба лектина проявляли одинаковую активность. Для лектина родительского штамма наблюдалось увеличение в 2 раза по сравнению с контролем, для лектина мутантного штамма - в 1,9 раза. Второе повышение начиналось в результате более длительного воздействия - через 23 ч и достигало максимума через 26 ч. Для лектина родительского штамма уровень оксида азота превосходил контроль в 2,5 раза, для лектина мутантного штамма - в 2 раза. Таким образом, различия между двумя лектинами наблюдались лишь в случае 26-часовой инкубации - лектин родительского штамма в большей степени активировал продукцию оксида азота в корнях (рис. 1).

Различия, проявляемые лектинами в данном случае, вероятно связаны с конформационными различиями молекул лектинов и как следствие, различным взаимодействием с поверхностью растительной клетки, что является определяющим фактором для включения последующих этапов.

По мнению многих авторов, в растениях может быть несколько источников образования NO и некоторые из них могут регулироваться через сигнальные пути (Glyan'ko et all, 2009; Flores et all, 2008) .Одним из таких путей является реакция, катализируемая синтазой оксида азота (NOS) по следующей схеме: α-аргинин + О2 + НАДФН → α-цитруллин + оксид азота. С целью доказательства того, что лектины способны индуцировать образование оксида азота таким способом, нами были предприняты попытки определения количества цитруллина в корнях после экспозиции в растворах лектинов. В результате было показано, что лектины родительского и мутантного штаммов в одинаковой степени вызывали постепенное увеличение количества цитруллина в растительной клетке лишь в первые часы их совместной инкубации с корнями. Максимальное количество цитруллина синтезировалось через 3 ч (рис. 2). Так как известно, что NO-синтаза растений является Са-зависимым ферментом (Corpas et all, 2009), было исследовано влияние кальция на синтез цитруллина. Добавление в среду инкубации корней проростков с лектинами ионов кальция в виде СаСl2 (1 мМ) активировало синтез аминокислоты в корнях, причем разницы между лектинами родительского и мутантного штаммов не наблюдалось (рис. 3), как и в случае без кальция.

Тот факт, что инкубация лектинов с корнями приводила к единовременному увеличению оксида азота и цитруллина в корнях, позволяет сделать вывод о том, что лектины способны активировать NO-сигнальную систему растений. Идентичность эффектов, вызываемых лектинами двух штаммов свидетельствует о том, что в данном случае эффект определялся специфическими взаимодействиями лектинов, учитывая, что они имеют одинаковую углеводную специфичность. Увеличение синтеза монооксида азота и отсутствие эффекта в отношении цитруллина при более длительном воздействии лектинов свидетельствует о том, что лектины способны регулировать уровень NO и через другие физиологические механизмы отличные от NO-синтазной сигнальной системы. По мнению Дьякова с соавт. (Дьяков и др., 2001) повышение концентрации NO приводит к активации гуанилатциклазы, катализирующей превращение ГТФ в цГМФ. цГМФ активирует протеинкиназу, которая открывает Са-каналы внутриклеточных Са-депо, в результате чего повышается концентрация кальция в цитозоле, активируются           Са-зависимые протеинкиназы, фосфорилируется белковый фактор регуляции транскрипции и начинается синтез специфических белков.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны увеличивать синтез оксида азота в корнях пшеницы. и тем самым, регулировать взаимодействие микро- и макросимбионта при формировании ассоциации на начальных ее этапах.