Изменения антиоксидантного статуса ротовой жидкости обучающихся рабочим профессиям в процессе прохождения производственной практики

Введение. Интенсификация учебной нагрузки на подростков, обучающихся рабочим профессиям, в процессе прохождения ими производственной практики, а также воздействие неблагоприятных производственных факторов отражаются изменениями физиологических и биохимических систем [1, 2].

Современный взгляд на персонализированную профилактическую медицину диктует необходимость выбора методов исследований, позволяющих своевременно и объективно оценивать ответную реакцию организма учащихся на воздействие неблагоприятных производственных факторов в условиях производственной практики [3].

Одним из звеньев системы неспецифической резистентности, обеспечивающей ответ организма на широкий спектр стрессорных повреждающих факторов за счет реализации ряда универсальных механизмов, является система антиоксидантной защиты [4–6].

Антиоксидантная система – многоуровневый и многокомпонентный механизм защиты от повреждающего действия свободных радикалов и реактивных молекул-окислителей [7, 8].

Развивающийся при многих патологических процессах и при дезадаптации окислительный стресс представляет собой типовой патологический процесс, характеризующийся активизацией свободнорадикальных процес- сов на фоне ослабления протективного действия антиоксидантных факторов [9–13]. Имеются сведения о влиянии вредных производственных факторов на работу оксидантных и антиоксидантных систем организма [14, 15].

В последнее время для мониторинга состояния окислительного метаболизма у разных групп испытуемых используют определение показателей ротовой жидкости [16].

Показано, что при отсутствии стоматологической патологии состояние прооксидант-но-антиоксидантной системы ротовой жидкости достаточно адекватно отражает состояние окислительного гомеостаза на системном уровне [17, 18]. Неинвазивный характер анализа рассматриваемой биологической жидкости обусловливает ее использование в мониторинге состояния метаболизма студентов в процессе обучения или прохождения практики как наиболее оправданное [19–21]. Поэтому перспективным направлением является оценка возможности лабораторных исследований показателей ротовой жидкости обучающихся для своевременного выявления процессов дезадаптации в процессе прохождения производственной практики и для профилактики их осложнений. Среди лабораторных показателей, заслуживающих внимания, особое место занимают маркеры окислительного стресса.

В доступной литературе данных об антиоксидантном статусе ротовой жидкости учащихся при прохождении производственной практики в процессе обучения рабочим профессиям в современных условиях обнаружено мало.

Цель исследования. Оценить изменения антиоксидантного статуса ротовой жидкости обучающихся профессии «станочник деревообрабатывающих станков» в процессе прохождения ими производственной практики.

Материалы и методы. Исследование проведено с участием 24 обучающихся учреждения среднего профессионального образования. Все они обучались профессии «станочник деревообрабатывающих станков» (3-й курс) и были представлены лицами мужского пола. Возраст испытуемых лиц на момент исследования составлял 18–19 лет.

В процессе производственной практики обучающиеся станочники деревообрабатывающих станков выполняют следующие виды работ: работа ручным инструментом – пиление, строгание, разметка, сверление, резание, долбление, сборка, склеивание, зачистка, раскрой, шлифование, крашение изделия; работа на станках – продольный и поперечный раскрой древесины, крупноразмерных плит и щитов, криволинейное пиление, фрезерование, базирование, сверление, строгание, долбление, вытачивание; столярное соединение деталей (сухим методом и склеиванием). При склеивании используются костный, казеиновый, карбамидный и поливинилацетатный клеи, в качестве растворителя – скипидар. Рабочая поза – стоя (до 60 % времени занятий). Кроме того, в процессе выполнения работы учащиеся осуществляют наклоны корпуса тела более 30º для подъема обрабатываемых деталей и установки их на станок, а также съема готовых изделий и укладки их на паллеты. На учащихся оказывают воздействие производственные вредности: вдыхание древесной пыли, выделяющейся при обработке древесины; вдыхание паров клеев и лаков; наличие интенсивного шума и вибрации, источниками которых являются деревообрабатывающие станки, электродвигатели и подвижные части технологических линий (уровень шума на рабочих местах в деревообрабатывающем цеху производственного обучения превышает 80 дБА). Длительность практики составляет 3 мес.

Критерием исключения было обозначено наличие стоматологических заболеваний, хронических заболеваний в стадии обострения или острых заболеваний по данным осмотра специалистами соответствующего профиля. Так как на момент повторного сбора ротовой жидкости четверо участников заболели острыми респираторными заболеваниями и были исключены из исследования, в исследовании учитывали данные только 20 испытуемых.

Ротовую жидкость собирали в начале производственной практики и по ее окончании методом сплевывания в объеме 3–4 мл в чистые пробирки из полимерного материала. Сбор биологического материала осуществляли всегда в аналогичных условиях: в 9–10 ч утра, в период максимальной секреции слюны, после предварительного (за 30 мин до сбора ротовой жидкости) ополаскивания полости рта дистил- лированной водой. За 2 ч до сбора биожидкости исключались: чистка зубов, прием пищи, табакокурение и другие вмешательства, способные модифицировать состав слюны [18]. Так как состав ротовой жидкости в значительно большей степени подвержен колебаниям, чем, например, состав крови, в начале и в конце исследования производили трехкратный забор биожидкости – три дня подряд в аналогичных условиях, после чего в расчет брали среднее значение каждого обучающегося.

Полученную ротовую жидкость центрифугировали в течение 15 мин при 2600 g, для дальнейших лабораторных исследований отбирали чистый прозрачный супернатант, а осадок утилизировали. В биожидкости определяли общую антиоксидантную активность (АОА), активность ферментов системы антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, а также содержание ТБК-активных продуктов, ключевым среди которых является продукт перекисного окисления липидов – малоновый диальдегид. Общую антиоксидантную активность определяли с помощью железо-восстанавливающего способа (FRAP), включающего инкубацию биожидкости с раствором, содержащим ионы железа (+3), восстанавливающиеся до состояния степени окисления +2. Ионы железа (+2) в свою очередь дают интенсивно окрашенный комплекс с 2,2’-дипиридилом, оптическая плотность которого пропорциональна содержанию антиоксидантов [22]. Для выполнения данной методики проводили инкубацию образца ротовой жидкости (0,1 мл) в реакционной смеси, содержащей Fe+3 и 2,2’-дипиридил в ацетатном буфере с рН 3,6 в течение 60 мин. После чего измеряли оптическую плотность раствора по сравнению с холостой пробой, содержащей деионизированную воду вместо биожидкости. Выражали общую АОА в мМ раствора аскорбиновой кислоты, принятого за стандарт.

Активность ферментов определяли кинетическими способами. Активность суперок-сиддисмутазы определяли по ингибированию аутоокисления кверцетина в системе с генерацией супероксидного анион-радикала. Для этого в реакционную смесь, содержащую квер- цетин и ротовую жидкость в фосфатном буфере (рН 8,35) с азидом натрия и ЭДТА, вносили раствор N,N,N',N'-тетраметилэтилендиа-мина. Скорость окисления кверцетина отслеживали в течение 10 мин при 406 нм. Результаты исследования активности СОД выражали в процентах, отражающих степень подавления окисления кверцетина в опытной пробе по отношению к контрольной пробе, содержащей дистиллированную воду вместо биожидкости.

Каталазную активность определяли по скорости разрушения пероксида водорода, содержание которого регистрировали при 260 нм. Для этого 200 мкл гемолизата эритроцитов (1:999) вносили в 2,5 мл 0,3 % раствора пероксида водорода в буферном растворе с рН 7,4. Реакцию останавливали через 5 мин внесением 300 мкл 50 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК). Полученные данные корректировали в соответствии с холостой пробой, в которую раствор ТХУК вносили до гемолизата [23].

Активность глутатионпероксидазы определяли по скорости расходования глутатиона в реакции восстановления гидропероксида трет-бутила. Для этого к 0,73 мл буферного раствора рН 8,5, содержащего восстановленный глутатион (1,5 мг/мл) и азид натрия (0,8 мг/мл), добавляли 200 мкл гемолизата эритроцитов (1:99). Затем инициировали реакцию внесением 50 мкл 0,05 % раствора третбутилгидропероксида. Через 10 мин останавливали реакцию ТХУК, в супернатанте после центрифугирования определяли концентрацию неизрасходованного глутатиона по реакции с дитиобис-нитробензойной кислотой [23].

Активность глутатионредуктазы определяли по скорости окисления НАДФН и снижения оптической плотности раствора при 340 нм при восстановлении окисленного глутатиона [23]. Для выполнения методики вносили 50 мкл гемолизата эритроцитов (1:9) к реакционной смеси, состоящей из 1,8 мл буферного раствора рН 7,0, по 0,1 мл окисленной формы глутатиона (12 мг/мл) и НАДФН (1,5 мг/мл). Изменение оптической плотности раствора отслеживали в течение 3 мин.

Содержание ТБК-активных продуктов определяли с использованием наборов реагентов «ТБК-АГАТ» (Россия).

Все исследования проведены с информированного добровольного согласия участников в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации 1964 г.

Статистический анализ данных проводили с использованием программы StatPlus 7 (AnalystSoft Inc.). Сравнение показателей на 1-м и 2-м этапах исследования осуществляли с использованием непараметрического критерия Уилкоксона для зависимых групп. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Данные были представлены в виде медианы и квартилей. Рисунки представлены в виде диаграмм типа box plot.

Результаты и обсуждение. Анализ показателей окислительного гомеостаза в ротовой жидкости студентов, проходящих производ- ственную практику, показал развитие статистически значимых изменений, на наш взгляд, отражающих адаптивные перестройки системы антиоксидантной защиты. При этом изменений уровня общей антиоксидантной активности и содержания продуктов окислительных модификаций биомолекул выявлено не было (табл. 1), что свидетельствует о поддержании общего состояния баланса анти- и прооксидантов на нормальном уровне и, вероятнее всего, не позволяет однозначно судить о развитии окислительного стресса у испытуемых лиц. Однако более детальный анализ показал развитие существенных модификаций функционального состояния ферментного звена системы антиоксидантной защиты.

Таблица 1

Table 1

Изменение показателей состояния баланса про- и антиоксидантной системы ротовой жидкости обучающихся в процессе прохождения практики, Ме (р0,25; р0,75)

Changes in prooxidant-and antioxidant system balance of oral fluid parameters in students during the apprenticeship (Ме (р0,25; р0,75))

Исследуемые показатели Parameters	Этапы исследования Study phase		р
	I (n=20)	II (n=20)
АОА, мМ вит. С General antioxidant activity, mM vit C	0,52 (0,48; 0,59)	0,55 (0,42; 0,72)	0,6835
ТБЧ, усл. ед. Thiobarbituric acid, c.u.	0,42 (0,32; 0,57)	0,32 (0,14; 0,43)	0,0926

В частности, анализ изменений активности ферментов системы глутатиона показал значительное снижение активности глутатионпероксидазы – в 5,3 раза, выявленное через 3 мес. после прохождения производственной практики, относительно исходных значений анализируемого показателя (рис. 1). Активность глутатионредуктазы при этом каких-либо изменений не претерпела. Активность ферментов системы глутатиона, как и концентрация самого глутатиона, в ротовой жидкости невелики, однако наличие значительных и статистически значимых изменений активности глутатионпероксидазы – наиболее уязвимого звена данной системы, непосредственно контактирующего с реактивными молекулами, свидетельствует о важной роли данной системы в поддержании редокс-гомеостаза в ротовой полости. Возможно, что в условиях развивающегося дисбаланса прооксидантно-антиоксидантной системы данный фермент принимает активное участие в нейтрализации активных форм кислорода, а также уже вторичных радикалов, частично сам повреждается, но скорость его обновления оказывается недостаточной. При этом глутатионредуктаза работает в относительно спокойных условиях, обеспечивая регенерацию небольшого количества глутатиона ротовой жидкости. В любом случае снижение активности глутати- онпероксидазы не оказывает решающего влияния на общее состояние редокс-гомеостаза в жидкостях полости рта, однако в качестве лабораторного маркера может служить чувстви- тельным критерием напряжения функционального состояния системы антиоксидантной защиты на этапе компенсации.

Этапы исследования / Study phase

Активность глутатионредуктазы

Glutathione reductase activity

Активность глутатионпероксидазы

Glutathione peroxidase activity

Рис. 1 . Изменение активности ферментов системы глутатиона ротовой жидкости обучающихся в процессе прохождения практики

(* – статистически значимые отличия между показателями на 1-м и 2-м этапах исследования (р≤0,05))

Fig. 1. Changes in the enzyme activity of the glutathione system in the oral fluid of students during the apprenticeship

(* – the differences between the parameters of the 1st and 2nd study phases are statistically significant (р≤0.05))

Наиболее выраженные изменения были выявлены при анализе активности ферментов первых двух линий антиоксидантной защиты. Активность супероксиддисмутазы и каталазы синхронно увеличивалась в ротовой жидкости испытуемых после прохождения производственной практики (рис. 2). Активность супе-роксиддисмутазы возрастала в 3,6 раза, а ката- лазная активность ротовой жидкости увеличивалась в 6,7 раза относительно исходных значений соответствующих показателей. Вероятно, усиление активности именно этих ферментов и оказывает решающее воздействие на сдерживание развития окислительных нарушений в ротовой жидкости.

Щ

ь о

Щ Е

Этапы исследования / Study phase

Активность супероксиддисмутазы                          Активность каталазы

Superoxide dismutase activity                                        Catalase activity

Рис. 2. Изменение активности ферментов антиоксидантной системы ротовой жидкости обучающихся в процессе прохождения практики (* – статистически значимые отличия между показателями на 1-м и 2-м этапах исследования (р≤0,05); единицы измерения активности супероксиддисмутазы – % ингибирования, активности каталазы – ммоль/(мин·л))

Fig. 2. Changes in the enzymes activity of the antioxidant system in the oral fluid of students during the apprenticeship ( * – the differences between the indicators of the 1^st and 2^nd study phases are statistically significant (р≤0.05); superoxide dismutase activity – percent of inhibition (%); catalase activity – mmol/(min·l))

Таким образом, выявленные изменения отражают функциональные перестройки ферментов системы антиоксидантной защиты – увеличение супероксиддисмутазной и каталазной активности, снижение активности глутатионпероксидазы на фоне сохранения общего баланса про- и антиоксидантов. Эти изменения можно трактовать как адаптивные, развивающиеся в ответ на окислительный стресс, который в данном случае можно обозначить как компенсированный. Компенсация происходит за счет напряжения функционального состояния ферментного звена антиоксидантной системы.

Заключение. Полученные данные подтвердили, что прохождение производственной практики обучающимися профессии «ста- ночник деревообрабатывающих станков» является для них стрессом. Развивается окислительный стресс, основные проявления которого компенсируются усилением активности ферментов системы антиоксидантной защиты. Однако выявленные особенности свидетельствуют о необходимости мониторинга состояния системы неспецифической резистентности у данной категории учащихся в процессе прохождения практики и проведения коррекции. При этом инструментом мониторинга может служить оценка лабораторных показателей ротовой жидкости, что ввиду неинва-зивности ее забора, отсутствия требований к специализированной подготовке персонала и наличию процедурного кабинета может осуществляться регулярно и дистанционно.