Изменения в миелоидном звене системы крови у стрессированных белых крыс с экспериментальным гипотиреозом

Актуальность исследования обусловлена важнейшей ролью гранулоцитов крови в защитных и адаптационных реакциях организма, которые могут существенно изменяться в условиях дефицита энергии, создаваемого гипотиреозом. На сегодняшний день сведений о состоянии миелоидного звена в условиях гипотиреоза в сочетании со стрессом в литературе крайне мало [5]. Становится очевидной необходимость исследований в этой области, что даст возможность расширить базу знаний об адаптивных возможностях организма к стрессорным факторам при гипотиреозе и разработать адекватные пути коррекции.

Цель исследования – выявление нарушений в миелоидном звене системы крови в условиях экспериментального гипотиреоза после стрессорного воздействия.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены на 48 беспородных белых крысах-самцах массой 180–200 г в осеннезимний период. Содержание, питание, уход соответствовали ГОСТ Р 5025892. Исследования проводились согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96). Гипотиреоз моделировали введением перорально (с кормом) мерказолила в дозе 10 мг/кг ежедневно в течение 8 недель [3, 7]. Иммобилиза-ционный стресс моделировали однократной 6часовой иммобилизацией на спине [6]. Крысы были разделены на 3 группы. Первая подопытная группа (ГS) включала 24 крыс, которым моделировали гипотиреоз, а затем (сразу после отмены мерказолила) – иммобилизационный стресс. Вторая группа (S) включала 16 крыс, которые подвергались только иммобилизационно- му стрессу. Восемь крыс оставались интактными и составили контрольную группу. Крыс выводили из эксперимента с помощью эфирной эвтаназии. Материал для исследования брали на 2-е сут. (стадия тревоги стресса [4]), 7-е сут. (стадия резистентности стресса) и 28-е сут. (отдаленные результаты) после отмены мерказоли-ла. Кровь для исследования брали из хвостовой вены, затем после эвтаназии извлекали бедренную кость для изучения красного костного мозга (ККМ). В периферической крови определяли количество лейкоцитов в 1л. Мазки крови и ККМ окрашивали по Паппенгейму [2]. В мазках крови подсчитывали лейкоцитарную формулу (с последующим пересчетом %-ного количества лейкоцитов в абсолютное), в мазках костного мозга – миелограмму (на 1000 клеток). Высчитывали индексы пролиферации (ИП) и созревания (ИС) клеток миелопоэза по формулам [1]: ИП=[(МЦ*0+ММЦ*1)/(МЦ+ММЦ)]*∑;

ИС=[(ММЦ*0+ПЯ*1+СЯ*2)/(ММЦ+ПЯ+СЯ)]* ∑, где МЦ – количество миелоцитов, ММЦ – количество метамиелоцитов, ПЯ – количество палочкоядерных гранулоцитов, СЯ – количество сегментоядерных гранулоцитов, ∑ – сумма всех клеток нейтрофильного, эозинофильного или базофильного ростка.

Полученные данные обрабатывали статистически с определением типа распределения вариационных рядов, среднего арифметического, ошибки среднего, среднего квадратичного отклонения [Statistica v.6]. Достоверность различий средних величин определяли по t-критерию Стьюдента при р<0,05.

Результаты исследования. У крыс с эутиреоидным статусом к концу стадии тревоги стресса (на 2 сутки) развивался лейкоцитоз, который сохранялся до 7 суток. У крыс с гипотиреозом (который характеризовался сохранением количества лейкоцитов в диапазоне нормы) стресс на 2-е сутки не вызывал лейкоцитоз, а к 7-е суткам наблюдения (в стадию резистетно-сти) провоцировал даже лейкопению, устраняемую только к 28-е суткам (рис. 1А).

А                                  Б

Рис. 1. Изменение количества лейкоцитов (*10⁹/л) в периферической крови (рис. А)

и клеток базофилопоэза из 1000 клеток (рис. Б) у стрессированных крыс с эутиреозом (S) и с гипотиреозом (ГS)

Численность базофилов в периферической крови не изменялась у обеих групп крыс на протяжении всего наблюдения (возможно, в связи с очень малой численностью этих клеток в крови). Вместе с тем в ККМ базофильный росток заметно изменялся (рис. 1-Б). У животных с эутирео-зом при стрессе на протяжении всего наблюдения количество клеток базофильного ростка в ККМ проявляло стойкую тенденцию к уменьшению. У крыс с гипотиреозом, наоборот, базофильный росток в стадии тревоги стресса сохранялся в диапазоне нормы, в стадии резистентно- сти увеличился в 4,7 раза (р<0,05), затем его численность постепенно снижалась, но даже к 28-м суткам превышала норму в 2,3 раза (р<0,05).

Количество эозинофилов в периферической крови у крыс с эутиреозом на 2-е сутки после стрессорного воздействия уменьшилось в 3 раза по отношению к норме (р<0,05), т.е. развивалась эозинопения (что является классическим признаком стадии тревоги стресса [4]), в стадии резистентности количество эозинофилов увеличивалось, приближаясь к норме (рис. 2).

Рис. 2. Динамика абсолютного количества эозинофилов в периферической крови у стрессированных крыс с эутиреозом (S) и с гипотиреозом (ГS)

В ответ на эозинопению в стадии тревоги у крыс с эутиреозом компенсаторно стимулируется пролиферация клеток эозинофильного ряда. При этом индекс пролиферации увеличивается почти вдвое (рис. 3 Б), а количество МЦ в 1,5 раза, ММЦ в 2,4 раза, по сравнению с интактными крысами (рис. 3 А). Вместе с тем индекс созревания снижен по сравнению с нормой в 2,7 раза, что ведет к опустошению костномозгового депо зрелых эозинофилов, которых становится в 3,3 раза меньше нормы (р<0,05, рис. 3 А, Б). В стадии резистентности созревание эозинофилов ускоряется вдвое, появляется резерв зрелых клеток, развивается тенденция к нормализации эо-зинофилопоэза.

При гипотиреозе под влиянием стресса эо-зинопения формировалась позже, через 7 суток после стрессорного воздействия, когда их количество уменьшилось в 2,7 раза по сравнению с интактными крысами (р<0,05), к 28-м суткам их количество в крови нормализовалось (рис. 3 А).

Перестройка эозинофилопоэза в ККМ под влиянием стресса у крыс с гипотиреозом тоже запаздывала, как и эозинопения, и отличалась торможением (а не активацией) пролиферации клеток. К 7-м суткам количество МЦ уменьшилось в 2 раза, ММЦ – в 1,5 раза, индекс пролиферации – в 1,6 раза (р<0,05, рис. 3 А, Б) по сравнению с нормальным значением. Созревание клеток тоже замедлялось, и резерв зрелых эозинофилов проявлял тенденцию к уменьшению (рис. 3 А). Лишь через 28 суток показатели эозинофилопоэза приближались к норме.

Таким образом, при эутиреозе в стадии тревоги стресса эозинопения сопровождалась кратковременным истощением резерва эозинофилов в костном мозге и компенсаторной стимуляцией эозинфилопоэза. В условиях гипотиреоза стресс, несмотря на эозинопению, не только не стимулировал эозинофилопоэз, но и существенно подавлял его активность, что тем не менее не приводило к опустошению костномозгового резерва зрелых эозинофилов, а лишь намечало тенденцию к его уменьшению. Эти данные дают основание считать, что при гипотиреозе эозинопения возникает в результате торможения миграции эозинофилов из костного мозга в кровь из-за дефицита энергии, создаваемого гипотиреоидным состоянием.

Рис. 3. Количество клеток эозинофилопоэза из 1000 клеток (рис. А), индекс пролиферации (ИП, усл. ед.) и созревания (ИС, усл. ед., рис. Б) у животных с эутиреозом (S) и стрессированных крыс с гипотиреозом (ГS)

Обозначения: МЦ – миелоциты, ММЦ – метамиелоциты, ПЯ – палочкоядерные эозинофилы, СЯ – сегментоядерные эозинофилы

Количество нейтрофилов у крыс с эутирео-зом в стадии тревоги стресса увеличивалось преимущественно за счет увеличения в 2 раза количества СЯ–нейтрофилов (р<0,05; рис. 4 А), которое в стадии резистентности нормализовалось. У крыс с гипотиреозом, имеющих изна- чально сниженное количество СЯ-нейтрофилов, стрессорное воздействие увеличило на 2-е сутки наблюдения численность этих клеток в 2,5 раза (р<0,05), что привело к нормализации этого показателя.

Рис. 4. Динамика абсолютного количества ПЯ-нейтрофилов (рис. А) и СЯ-нейтрофилов (рис. Б) в периферической крови у крыс с эутериоидным статусом (S) и стрессированных крыс с гипотиреозом (ГS) из 100 клеток

Однако с 7-х суток наблюдения количество нейтрофилов в крови этих крыс резко уменьшалось, при этом ПЯ-нейтрофилы совсем не обнаруживались, а численность СЯ-нейтрофилов уменьшилась в 2 раза (р<0,05, рис. 4 Б), по сравнению с интактными крысами. На основании этих данных можно говорить о формировании под действием стресса в условиях гипотиреоза устойчивой нейтропении с отсутствием ПЯ-нейтрофилов.

В нейтрофильном ростке ККМ после стрессорного воздействия у крыс и с эутирео-зом, и с гипотиреозом на 2-е сутки наблюде- ния в ККМ происходило уменьшение количества всех клеток нейтрофильного ряда. При эутиреозе количество МЦ и ММЦ было в 1,9 раза меньше нормы, при гипотиреозе – в 1,6 раза (рис. 5 А).

в мд   D мщ   □ гя D ся

А

□ип -о-ис

Б

Рис. 5. Количество клеток нейтрофилопоэза из 1000 клеток (рис. А), индексы пролиферации и созревания (усл. ед., рис. Б) у крыс с эутиреозом (S) и стрессированных крыс с гипотиреозом (ГS). Обозначения: МЦ – миелоциты, ММЦ – метамиелоциты, ПЯ – палочкоядерные нейтрофилы, СЯ – сегментоядерные нейтрофилы, ИП – индекс пролиферации, ИС – индекс созревания

Резерв ПЯ- и СЯ-нейтрофилов при эути-реозе уменьшился в 1,7 и 2,4 раза соответственно, а при гипотиреозе – в 2,5 и 3 раза по сравнению с интактными крысами (р<0,05, рис. 5 А). При этом скорость деления бластных форм (ИП) и созревание СЯ-нейтрофилов (ИС) у крыс с эутиреозом снизились в 2 раза, а у крыс с гипотиреозом – в 2,5 раза по сравнению с нормальным значением (р<0,05, рис. 5 Б). Таким образом, через 2 суток после стрес-сорного воздействия, независимо от тиреоидного статуса, в ККМ происходит истощение резерва зрелых нейтрофилов в результате торможения нейтрофилопоэза в сочетании с усиленным выбросом нейтрофилов в кровь.

Через 7 суток после стрессорного воздействия при эутиреозе в ККМ количество клеток нейтрофильного ряда и их пролиферация нормализовались (рис. 5 А), но скорость созревания (ИС) осталась по-прежнему низкой по сравнению с нормой (рис. 5 Б). У стрессированных крыс с гипотиреозом на 7-е сутки наблюдения пролиферация и созревание нейтрофилов еще больше замедлялись и количество клеток нейтрофильного ряда было по-прежнему низким, но через 28 суток экспери- мента пролиферация бластных форм нормализовалась, а созревание ускорилось и в 1,4 раза и превышало норму (р<0,05, рис. 5 Б), что привело к нормализации количества клеток нейтрофильного ряда (рис. 5 А). Таким образом, при эутиреозе численность нейтрофильного ростка нормализовалась уже на 7-е сутки (в стадию резистентности стресса), а при гипотиреозе – лишь на 28-е сутки наблюдения.

Выводы

• 1.    Иммобилизационный стресс вызывает при эутиреозе лейкоцитоз в стадии тревоги (на 2-е сутки), а у крыс с гипотиреозом – лейкопению в стадию резистентности (на 7-е сутки).

• 2.    Количество базофилов в периферической крови не зависит от тиреоидного статуса и не изменяется под влиянием стресса, но численность клеток базофильного ростка ККМ под влиянием стресса у крыс с эутиреозом проявляет стойкую тенденцию к уменьшению, а у крыс с гипотиреозом увеличивается в 4,7 раза (р<0,05) в стадию резистентности.

• 3.    Под влиянием стресса независимо от тиреоидного статуса развивается эозинопения, но при эутиреозе – на 2-е сутки наблюдения, а при

• 4.    Независимо от тиреоидного статуса стрессорное воздействие приводит к увеличению в стадии тревоги (2-е сут.) количества нейтрофилов в крови, формируя при эутиреозе лейкоцитоз и нейтрофилию со сдвигом лейкоцитарной формулы влево, а при гипотиреозе – компенсируя исходную нейтропению за счет нормализации численности нейтрофилов. Этот эффект стресса обусловлен усиленным выбросом нейтрофилов из костного мозга в кровь и сопровождается торможением нейтрофилопоэза с истощением резерва зрелых нейтрофилов.

• 5.    В стадию резистентности стресса (7-е сут.) при эутиреозе количество нейтрофилов в крови нормализуется за счет активации ней-трофилопоэза, а при гипотиреозе развивается устойчивая нейтропения со сдвигом лейкоцитарной формулы вправо на фоне углубляющегося торможения нейтрофилопоэза, который активизируется лишь к 28-м суткам наблюдения.

гипотиреозе – на 7-е сутки. Эозинопения при эутиреозе временно истощает резерв зрелых эозинофилов в костном мозге и компенсаторно стимулирует эозинфилопоэз, а при гипотиреозе она обусловлена торможением миграции эозинофилов из костного мозга в кровь и сопровождается лишь тенденцией к уменьшению костномозгового резерва этих клеток на фоне подавления активности эозинофилопоэза.

Заключение. Хорошо известно, что низкий уровень тиреоидных гормонов, свойственный гипотиреоидному состоянию, приводит к нарушению основного обмена и дефициту энергии [5, 7], которая необходима для реализации всех защитных реакций организма, в том числе адаптационной. При стресс-реакции происходит мобилизация энергетических ресурсов за счет активации гипоталамо-гипо-физо-адреналовой и адренергической систем, которая в стадии тревоги стресса приводит к повышению в крови уровня катехоламинов и глюкокортикоидов [4], влияющих на метаболизм. По-видимому, эти гормоны в условиях гипотиреоза могут частично компенсировать недостаток регуляторных влияний на метаболизм со стороны тиреоидных гормонов и временно (на период стадии тревоги стресса)

уменьшить дефицит энергии в клетках. По данным проведенного исследования, это проявляется временной нормализацией гранулоцитарного состава крови. Вероятно, этот эффект стресса в условиях гипотиреоидного состояния следует считать положительным. Вместе с тем, как убедительно показали результаты исследования, в условиях гипотиреоза «ценой» этого кратковременного улучшения является резкое ослабление гранулоцитарных ростков с истощением резерва нейтрофилов в стадии резистентности стресса, развитием лейкопении со сдвигом лейкоцитарной формулы вправо, что, безусловно, является негативным для организма. В совокупности полученные данные дают основание считать, что в условиях дефицита энергии, создаваемого гипотиреозом, гранулоциты не способны адекватно реагировать на стрессорное воздействие и осуществлять свои защитные функции.