Изучение антибактериального действия нано-частиц меди и железа на клинические штаммы Staphylococcus aureus

Введение. В течение последних 15 лет

Staphylococcus aureus является одним из ведущих

410002 г. Саратов, ул. Чернышевского, 148

ФГУ «Саратовский НИИ травматологии и ортопедии

возбудителей послеоперационных и посттравматических гнойных раневых осложнений в травматологии и ортопедии, таких как остеомиелит, абсцесс, флегмона. В связи с частым возникновением множественной антибиотикоустойчивости штаммов Staphylococcus aureus необходим поиск новых высокоэффективных антибактериальных препаратов [1]. Наночастицы меди проявляют ярко выраженную биологическую активность, в том числе бактериостатическое и бактерицидное действия. Имеются отдельные примеры изучения бактерицидного эффекта наночастиц железа и меди на штаммы E.coli, St.aureus [2]. Препараты меди, введённые в организм животных в виде наночастиц, обладают пролонгированным действием и меньшей токсичностью по сравнению с солями. Наночастицы меди при введении в организм стимулируют механизмы регуляции микроэлементного состава и активность антиоксидантных ферментов [3, 4, 5]. Наночастицы железа как в виде водной суспензии при подкожном введении, так и в виде мази при нанесении на раны обладают ярко выраженным ранозаживляющим эффектом [6]. На основе нанопорошков железа и меди были получены и апробированы препараты для ускоренного ранозаживления и лечения ожогов. Наночастицы металлов являются перспективным претендентом на создание нового класса антибактериальных препаратов [7].

Одной из главных причин изменения физических и химических свойств малых частиц по мере уменьшения их размеров является рост относительной доли «поверхностных» атомов. С энергетической точки зрения уменьшение размеров частицы приводит к возрастанию роли поверхностной энергии. Уменьшение частиц до нанометровых размеров приводит к проявлению в них так называемых «квантовых размерных эффектов». В настоящее время уникальные физические свойства наночастиц, возникающие за счёт поверхностных или квантово-размерных эффектов, являются объектом интенсивных исследований [8, 9].

Целью работы явилось сравнительное изучение антибактериального действия наночастиц железа и меди на клинические штаммы золотистого стафилококка.

Методы. Исследования проводились на 10 штаммах Staphylococcus aureus, выделенных от больных с гнойными осложнениями, находящимися на лечении в травматолого-ортопедическом стационаре Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИТО) и обладающих резистентностью к пяти- и более профильным антибиотикам. В пробирки с разведениями нанопорошка добавляли по 100 мкл конечной суспензии (300000 КОЕ/мл) микроорганизмов, встряхивали и инкубировали в течение 30, 60, 120, 180 мин при комнатной температуре. В качестве контроля использовали такие же количества бактериальной взвеси, разведённые в аналогичных пропорциях с физиологическим раствором и также выдержанные в течение тех же промежутков времени. После этого бактериальные взвеси, с каждой концентрации нанопорошков в количестве 100 мкл, высевали на чашки Петри с твёрдой питательной средой (мясо-пептонный агар), которые затем помещали в термостат на 24 часа при 37˚С. Подсчёт колоний производили на следующий день.

Нанопорошки любезно предоставлены Саратовским плазмохимическим комплексом ФГУП РФ ГНЦ ГНИИ химической технологии элементоорганического синтеза (г. Москва).

Нанопорошок металлов получают из крупнодисперсного порошка меди марки ПМС1 ГОСТ 4960 – 75 и порошка железа марки Р-10 ГОСТ 13610 – 79 с помощью плазменной технологии, основанной на испарении сырья (крупнодисперсного порошка или прутка) до ультрадисперсных частиц требуемого размера в плазменном потоке с температурой 5000-6000 ^о К и конденсации пара, дисперсность частиц меди 30-40 нм, частиц железа – 30-70 нм. Готовили взвесь нанопорошков в 0,9%-ном растворе NaCl в концентрациях, равных 0,001; 0,01; 0,1; 1мг/мл.

Производили статистическую обработку материала с подсчетом средних значений (М), их среднеквадратичных ошибок (m) и уровня достоверности (p).

Результаты. Установлено, что характер влияния наночастиц на рост клинических штаммов и выраженность антибактериального эффекта зависят от вида наночастиц, их концентрации, времени воздействия на бактериальную взвесь.

Результаты подсчёта количества колоний Staphylococcus aureus, выросших на твёрдых питательных средах, после воздействия различных концентраций наночастиц железа в течение 30-180 мин, а также результаты подсчёта в контрольной группе, не подвергавшейся влиянию ультрадисперсных порошков, представлены в таблице 1.

После воздействия наночастиц железа в низких концентрациях – 0,001 мг/мл и 0,01 мг/мл при времени воздействия до 60 минут не отмечается достоверного изменения количества колоний на твердых питательных средах. При увеличении времени инкубации до 120-180 минут наблюдалось статистически достоверное увеличение количества колоний на твердых питательных средах от 6 до 45% (p <0,050,01). Использование более высоких концентраций – 0,1 и 1 мг/мл вызывало статистически достоверное снижение количества бактериальных клеток – от 3 до 34% по мере увеличения экспозиции (p <0,05-0,01).

Зависимость характера влияния нанопорошка железа в различных концентрациях на рост клиниче-

Таблица 1

Антибактериальное действие различных концентраций наночастиц железа на клинические штаммы золотистого стафилококка

Время воздействия, мин.	Количество колоний на твердых питательных средах (М±m)
	Контрольная группа (n=10)	Опытные группы
		1	2	3	4
		0,001 мг/мл, n=10	0,01 мг/мл, n=10	0,1 мг/мл, n=10	1 мг/мл, n=10
30	1234,2±46,7	1348,5±86,7	1064,6±112,0	1107,5±23,7 *	1098,7±22,5**
60	1380,7±31,3	1251,0±95,4	1245,4±78,3	1186,8±44,7 ***	1159,2±60,1***
120	954,1±23,5	1064,9±47,0*	1218,7±31,9 ***	849,1±18,8***	629,6±18,5***
180	1056,0±68,0	1314,2±71,7**	1449,8±67,5 ***	824,3±41,7**	728,6±38,1***

Примечание: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

ских штаммов Staphylococcus aureus представлена на рисунке.

Таким образом, наночастицы железа в низких концентрациях (0,001 и 0,01 мг/мл) оказывают ростстиму-лирующее, а в более высоких концентрациях (0,1 и 1 мг/мл) обладают антимикробным действием в отношении клинических штаммов золотистого стафилококка.

Антибактериальная активность наночастиц меди колеблется в широком диапазоне концентраций от 0,001 мг/мл до 1 мг/мл. Результаты подсчёта количества колоний Staphylococcus aureus, выросших на твёрдых питательных средах, после воздействия различных концентраций наночастиц меди в течение 30-180 мин, а также результаты подсчёта в контрольной группе, не подвергавшейся влиянию ультради-сперсных порошков, представлены в таблице 2.

Концентрация 1 мг/мл даже при кратковременном воздействии (30 мин) вызывает полное уничтожение микробных клеток. 30-минутное действие меньшей концентрации (0,1 мг/мл) также вызывает значительное уменьшение числа колоний, выросших на мясопептонном агаре, – на 98% (p<0,001). Концентрации 0,01 мг/мл и 0,001 мг/мл способствуют снижению количества колоний на твердой питательной среде на 97 и 96% соответственно при экспозиции, равной 30 мин (p<0,001). Дальнейшее увеличение времени инкубации приводит к отсутствию роста на твердых питательных средах при использовании всех концентраций нанопорошков меди.

Таким образом, установлена высокая антибактериальная активность наночастиц меди в отношении полиантибиотикорезистентных клинических штаммов золотистого стафилококка, являющегося одним из наиболее частых возбудителей гнойно-воспалительных осложнений в травматологии и ортопедии.

Обсуждение. Наночастицы меди обладают многосторонним действием на бактериальную клетку. В частности установлено, что после обработки клеток медью происходит утечка из них катионов К ⁺ . Эти данные свидетельствуют о том, что барьерные свойства мембраны нарушаются при взаимодействии с ионами меди, концентрация которых определяется совокупностью окислительно-восстановительных процессов в примембранном пространстве [9].

Наночастицы меди в отличие от антибиотиков не вызывают селекции резистентных штаммов, что позволяет в дальнейшем рекомендовать для использования при лечении гнойных заболеваний, вызванных полиантибиотикорезистентными штаммами золотистого стафилококка.

Количество клеток,%

Рис. Влияние наночастиц железа на клинические штаммы Staphylococcus aureus

Наночастицы железа обладают меньшей устойчивостью к окислению, образованием оксидной пленки на поверхности наночастиц, возможно, объясняется их меньший антибактериальный эффект при всех изученных концентрациях, а эффект стимуляции роста клеток стафилококка, вероятно, связан с тем, что его штаммы обладают способностью усваивать ионы железа из внешней среды [8].

Заключение. Таким образом, наночастицы меди обладают выраженным антибактериальным действием при использовании низких концентраций, значительно превышающим антимикробный эффект наночастиц железа, который проявляется только при использовании в высоких концентрациях.

Настоящее исследование выполнено в соответствии с основным планом НИР ФГУ «СарНИИТО Росмедтехнологий».