Изучение антиоксидантной активности липидной фракции трутовика лекарственного (Fomitopsis officinalis (Vill.) Bond. et Sing.)

Тираспольская Светлана Григорьевна, кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии окисления и активностью данной системы, которая поддерживает процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) на стационарном, достаточно низком уровне в условиях значительных изменений в образовании свободных радикалов. Различают ферментативное и неферментативное звено АОЗ. Неферментативная АОЗ связана с участием таких соединений, как биогенные элементы, витамины А, С, Е, ненасыщенные жирные кислоты, флавоноиды, стероидные гормоны. Поэтому поиск растительных объектов, содержащих перечисленные группы соединений, практически не обладающих токсическим действием на организм и оказывающих антиоксидантное действие, является актуальным [5]. Современные исследования ученых доказали, что растительные, а не синтетические антиоксиданты помогают организму снижать уровень повреждения тканей, ускорять процесс выздоровления, предотвращать многие сердечно-сосудис-тые, инфекционные и онкологические заболевания.

Одним из природных объектов является лиственничная губка, или трутовик лекарственный, или белый агарик (Fomitopsis officinalis (Vill.) Bond.et Singer, сем. Polyporaceae). Известно, что плодовое тело гриба, паразитирующего на лиственнице, реже пихте накапливает до 80% смолистых веществ кислотного характера, в том числе агарициновую кислоту [4]. В народной медицине более столетия как само измельченное плодовое тело, так отвары и настойки трутовика применяют для профилактики онкологических заболеваний. Однако в научной литературе данные о химическом составе и фармакологической активности извлечений из трутовика лекарственного немногочисленны [1].

Цель исследования: выделение липидной фракции из плодового тела трутовика лекарственного, изучение ее химического состава и антиоксидантной активности (АОА) по степени уменьшения концентрации комплекса продуктов окисления с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Материалы и методы исследования . Получение липидной фракции из плодового тела трутовика лекарственного проводили путем исчерпывающей экстракции измельченного плодового тела трутовика в аппарате Сокслета смесью растворителей хлороформ-спирт этиловый 1: 2. Полноту экстракции контролировали методом тонкослойной хроматографии по отсутствию характерного пятна агарициновой кислоты. После выделения и очистки из липидной фракции агарициновой кислоты остаток упаривали, высушивали при температуре 40⁰ С до постоянной массы, взвешивали. Проводили определение жирнокислотного состава трутовика методом газовой жидкостной хроматографии [1]. Около 0,1 г липидной фракции трутовика (точная навеска) помещали в колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 1 мл спирта метилового и 3 капли ацетилхлорида и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 ч. Избыток спирта метилового отгоняли. Остаток растворяли в 0,2 мл гексана. Количественное определение проводили методом внутренней нормализации. Разделение компонентов проводили на газовом хроматографе «Цвет 500» с пламенно-ионизационным детектором. Компоненты идентифицировали по стандартным образцам (Sigma) метиловых эфиров жирных кислот [3].

Антиоксидантное действие исследуемого объекта было изучено in vitro на модели Fe2+-индуцированного ПОЛ в системе, полученной на основе постъядерной фракции печени (ПФП). Для получения ПФП после декапитации животных (крысы линии Wistar) печень перфузировали холодным 0,125 M раствором калия хлорида, затем быстро извлекали и дополнительно охлаждали 3-5 мин на льду, содержащем 100 мМ трис-НС1 буфер (рН 7,4), на котором готовили гомогенат в соотношении 1: 7. Навеску печени продавливали через стеклянный пресс и гомогенизировали со средой выделения на холоде в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком 30 секунд. ПФП получали центрифугированием при 600 g в течение 10 мин при 4°С. При изучении индуцированного (аскорбат-Fe+2-зависимого) ПОЛ инкубационная среда содержала 100 мМ трис HCl, pH 7,4, 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, 12 мкМ cоль Мора. Реакцию проводили на водяной бане при 37°С и определяли уровень продуктов ПОЛ [2]. С этой целью в нулевое время и через 20 минут инкубации отбирали по 0,5 мл суспензии, смешивали на холоде с 1 мл 30% раствора трихлоруксусной кислоты. Полученную смесь центрифугировали при 3 тыс. об/ мин. 15 минут. К надосадочной жидкости добавляли 0,1 мл 5 М раствора кислоты хлористоводородной и 1 мл 0,6% раствора ТБК в 0,5 М сульфате натрия, нагревали на водяной бане 15 минут при 100°С. После охлаждения до комнатной температуры записывали спектр поглощения ТБК-активных продуктов на СФ- LEKI SS 1207UV при длине волны 535 нм и рассчитывали количество ТБК-активных продуктов, используя коэффициент молярной экстинкции МДА – 1,56х105М-1см -1. Результаты выражали в нмоль на 1 мг белка в реакционной смеси.

Эффективность антиоксидантного действия оценивали по степени ингибирования интенсивности ПОЛ в ПФП в опытных образцах по отношению к контрольным. В опытные пробы вносили исследуемые объекты в виде растворов в ДМСО в конечной концентрации 100 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,13 мкг/мл. В контрольные пробы добавляли только растворитель (вода очищенная и ДМСО соответственно). Рассчитывали процент торможения ПОЛ по отношению к контрольной пробе. В качестве критерия оценки АОА рассчитывали значение коэффициента I 50 , который показывает концентрацию вещества в среде инкубации, вызывающую снижение интенсивности ПОЛ на 50%.

Результаты и обсуждение . Содержание липидной фракции составило 57,6% по отношению к массе сухого плодового тела трутовика. Установлено, что липидная фракция содержит ненасыщенные жирные кислоты (табл. 1). В таблице 2 представлены данные о влиянии исследуемого образца на накопление ТБК-актив-ных продуктов в следующих конечных концентрациях: 100 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,13 мкг/мл. Как видно из таблицы 2, липиды трутовика способствуют снижению накопления перекисных соединений по сравнению с контролем. Так, уже в концентрации 6,25 мкг/мл по сравнению с раствором ДМСО отмечено снижение накопления продуктов ПОЛ на 23%. Повышение конечной концентрации исследуемого образца до 100 мкг/мл привело к большему снижению интенсивности ПОЛ – на 63%. Значение коэффициента I 50 для исследуемого объекта составило 70,9 мкг/мл.

Таблица 1. Результаты определения жирнокислотного состава липидной фракции плодо-