Изучение ДНК методом комбинационного рассеяния

В настоящее время накоплен значительный объем знаний о структурных особенностях ДНК различных организмов при разных функциональных состояниях. Имеется много данных о полиморфизмах генов, связанных с изменением структуры и функциональной активности ДНК. Повышенный интерес исследователей связан с изучением механизмов регуляции генной экспрессии, основанных на взаимодействии белковых и небелковых факторов транскрипции. Анализ различного рода взаимодействий биомолекул с ДНК представляет новое направление исследований, выполняемых при помощи различных методов. Нами были проведены исследования ДНК с помощью метода комбинационного рассеяния.

В исследованиях применяется спектрометр комбинационного рассеяния, позволяющий регистрировать спектры комбинационного рассеяния твердых и жидких проб различного происхождения и измерение содержания веществ, находящихся в составе исследуемых проб, на основе полученных спектров. Спектр КР исследуемого вещества представляет собой зависимость интенсивности КР от частотного сдвига. Изменение положения максимума пика в спектре КР или изменение относительной интенсивности пика связаны с изменением параметров связи/связей в молекуле и, следовательно, свидетельствуют об изменении конформации молекулы. Преимуществами КР-спектроско-пии является высокая чувствительность к незначительным изменениям в структуре исследуемых веществ, а также ее использование не только для твердых веществ и газов, но и растворов, поскольку КР-воды очень мало. Одним из недостатков спектроскопии КР является относительно небольшая вероятность явления КР и его конкуренция с более вероятными событиями, в частности, флуоресценцией. Однако оно наблюдается, поскольку характерное время процесса КР составляет порядка 10-11 с, а время процесса флуоресценции – 10-9 [1].

Исследования ДНК с помощью метода комбинационного рассеяния изложены в нескольких работах, на результаты которых мы опираемся при разработке

экспериментального подхода с использованием рамановского спектрометра in via Basis фирмы Renishaw (Великобритания) с короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250 мм) [2]. Изолированную ДНК растворяли в 100 мМ раство- ре NaCl. Концентрация ДНК в растворе равнялась 40 мкг/мл.

Для анализа ДНК использовались определенные характерные полосы спектра КР в диапазоне частотного сдвига от 0 до 2000 см- 1, которые позволяют исследовать структурные изменения в данной макромолекуле (таблица).

Таблица

Значения Раман-спектра

Пики 785 – 792 и 1 092 – 1 096 см-1 связаны с симметричными колебаниями метафосфата (связи О – Р – О). Пик 1 255 см-1 связан с колебанием азотистых оснований цитозина, аденина; 1 581 – 1 585 см-1 – с гуанином, аденином. Пик 1442 см-1 связан с колебанием дезоксирибозы.

В процессе анализа спектров КР ДНК до и после некоторого воздействия для разных проб оценивался «набор» полос в спектре КР без ана- лиза интенсивностей полос. При таком подходе отслеживается смещение полос относительно основных связей. Анализируется соотношение интенсивностей определенных полос спектра КР.

Для определения конформационных перестроек в ДНК мы предлагаем использовать следующие отношения интенсивностей при определенных частотах: 785/1 092; 1 442/1 092; 1 255/1 092; 1 581/1 092.