Изучение фенольных соединений гомеопатической матричной настойки Asarum europaeum

Поиск эффективных лекарственных средств из растительного сырья и совершенствование методов стандартизации является актуальной задачей фармацевтической науки. В последние годы большое внимание уделяется физикохимическим и фармакологическим исследованиям тех лекарственных растений, которые применяются как в официнальной, так и в народной медицине. Одним из таких растений является копытень европейский (Asarum еигораеит L.') семейства Кирказоновые (Aristolochiaceae), который в настоящее время используется в гомеопатии и народной медицине [1; 2]. По научным данным, в сырье копытня содержатся биологически активные вещества различных классов: эфирное масло, фенольные соединения, органические кислоты, витамины и др. [3-6].

Цель исследования: изучение фенольных соединений настойки гомеопатической матричной (НГМ) Asarum europaeum.

Материалы и методы

Сырьем для получения НГМ служило свежесобранное и высушенное сырье копытня европейского (Asarum еигораеит L.\ заготовленное в 2009-2010 гг. в ботаническом саду ГНУ ВИ-ЛАР.

Изготовление настоек из свежего и высушенного лекарственного растительного сырья (ЛРС) (корневища с корнями и листья) копытня европейского производят в соответствии с методами 3 и 4 ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные».

Свежее сырье измельчают и прибавляют половинное количество по массе 86%-ного спирта. Количество спирта в килограммах, необходимое для приготовления настойки вычисляют по формуле:

2-М-Р

100 , где М - масса растительного материала, кг;

D - потеря в массе при высушивании,%.

Рассчитанное количество спирта прибавляют к смеси и мацерируют не менее 8-ми суток при ежедневном перемешивании. Затем массу отжимают, жидкость помещают в плотно закрывающийся сосуд для отстаивания в течение 8-ми суток, после чего фильтруют.

Настойки из высушенного лекарственного растительного сырья изготовляют методом мацерации. Одну часть измельченного и высушенного сырья копытня европейского заливают 10 частями 62%-ным по массе (70%-ным по объему) спиртом и мацерируют не менее 8-ми суток при ежедневном перемешивании. Затем жидкость сливают, массу отжимают под прессом, обе жидкости сливают вместе и оставляют в плотно закрытой таре для отстаивания не менее чем на 8 суток, затем фильтруют.

Анализ фенольных соединений проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе (ВЭЖХ) фирмы «GILSON» (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «МультиХром» для «Windows». Для разделения компонентов была использована колонка размером 4,6 х 250 мм Kromasil С 18, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы - система растворителей метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная, в соотношении 400:600:5. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Объем вводимой пробы 50 мкл. Продолжительность анализа 60 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора “GILSON” UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм.

В качестве свидетелей использовали 0,1% растворы рутина, гиперозида, лютеолина, люте-олин-7-гликозида, галловой, хлорогеновой, кофейной кислот в спирте метиловом.

Результаты исследования и обсуждение

Оценка хроматограммы проводилась по времени удерживания и площади пика в автоматическом режиме.

Проведено изучение состава фенольных соединений НГМ из свежего и высушенного сырья (рис. 1, 2). В сырье копытня европейского определено 21 вещество, из них идентифицировано 14. Методом внутренней нормализации опреде- лено содержание веществ, при этом превалирующим соединением является хлорогеновая кислота (около 19,25%) (табл. 1). Найдены также галловая кислота, эпикатехин, эпигаллокатехин-галлат, флавоноиды и фенолкарбоновые кисло ты. Состав фенольных веществ НГМ близок к таковому ЛРС. Различий в составе НГМ в зависимости от состояния используемого ЛРС (свежее или высушенное) не выявлено.

Рис. 1. Хроматограмма ВЭЖХ НГМ (из высушенного ЛРС)

Рис. 2. Хроматограмма ВЭЖХ НГМ (из свежего ЛРС)

Таблица 1

№	Соединение РСО	Время удерживания, мин	Содержание в пересчете на абс. сух. сырье % в ЛРС копытня европейского
			Свежее	Высушенное
1	Неидентифицированное	3,056	1,62	1,70
2	Неидентифицированное	3,398	3,62	3,59
3	Танин медицинский	3,745	10,62	10,64
4	Галловая кислота	3,852	15,14	15,11
5	Хлорогеновая кислота	3,987	19,17	19,20
6	Эпигаллокатехингаллат	4,781	18,36	18,38
7	Цикориевая кислота	6,615	13,22	13,25
8	Неидентифицированное	7,51	3,77	3,75
9	Кофейная кислота	8,006	0,45	0,42
10	Неидентифицированное	9,165	0,21	0,21
И	Неидентифицированное	10,72	1,39	1.39
12	Феруловая кислота	11,78	0,09	0,09
13	Эпикатехин	12,69	0,05	0,04
14	Рутин	16,86	0,11	0,09
15	Лютеолин	19,42	0,11	0,10
16	Лютеолин-7-гликозид	22,38	0,92	0,90
17	Коричная кислота	26,66	0,23	0,21
18	Неидентифицированное	28,11	1,91	1,92
19	Кверцетин	32,73	4,20	4,21
20	Кемпферол	55,85	2,41	2.40
21	Неидентифицированное	58,23	2,40	2.41
		60	100,00	100,00

Результаты исследования фенольных соединений в корневищах копытня европейского методом ВЭЖХ

Количественное определение суммы флавоноидов проводили спектрофотометрическим методом с использованием реакции комплексообразования с алюминием хлорида. Установлено, что УФ-спектры комплексов флавоноидов НГМ и стандартного образца ГСО рутина с А1С1з имеют совпадающие максимумы при длине волны 415 нм.

Методика. Содержание суммы флавоноидов определяют в пересчете на рутин, используя ГСО рутина в 95%-ном спирте. Для этого около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина (ФС 422508-87) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50 мл спирта и доводят тем же спиртом до метки, перемешивают (стандартный раствор).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл испытуемого раствора, прибавляют 2 мл 2%-ного раствора алюминия хлорида в 95%-ном спирте и доводят объем тем же спиртом до метки, перемешивают и через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на саморегистрирующем спектрофотометре «Гелиос» при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл испытуемого раствора, 0,1 мл разведенной уксусной кислоты и доводят 95%-ным спиртом до метки (раствор должен быть свежеприготовленным).

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного следующим образом: 1 мл стандартного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2%-ного раствора алюминия хлорида в 95%-ном спирте и доводят объем тем же спиртом до метки.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в процентах (X) вычисляют по формуле:

_х_ D-m_o -1-25 -100

~ D_o- 1-100- 25

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

т0 - навеска РСО рутина;

Do - оптическая плотность стандартного раствора рутина.

Содержание флавоноидов в пересчете на рутин в исследуемых НГМ из копытня составляет около 0,09% (свежее сырье) и 0,08% (высушенное сырье).

Методика. 1 мл НГМ помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят до метки 70%-ным спиртом (испытуемый раствор) и измеряют оптическую плотность в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 269 нм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора РСО хлорогеновой кислоты.

Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту рассчитывают по формуле:

_ П-т-2-250-100

" ^со-100-100-1 , где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

Dpco - оптическая плотность раствора РСО хлорогеновой кислоты;

m - навеска РСО хлорогеновой кислоты, г.

Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в НГМ копытня европейского составляет около 0,62% (свежее сырье) и 0,54% (высушенное сырье).

Выводы

• 1.    Изучен качественный состав веществ фенольного характера методом ВЭЖХ, при этом установлено присутствие 21 вещества, из которых идентифицировано 14. Доминирующим компонентом является хлорогеновая кислота.

• 2.    Оценено содержание флавоноидов НГМ из высушенного (0,085%) и свежего (0,09%) сырья методом спектрофотометрии в пересчете на рутин.

• 3.    Установлено содержание суммы веществ фенольного характера в пересчете на хлорогеновую кислоту в НГМ из высушенного и свежего сырья составляют соответственно 0,54% и 0,62% методом спектрофотометрии.