Изучение функциональной значимости конфликтного варианта гена RAD51D при раке молочной железы
Автор: Молоков А.Ю., Гервас П.А., Коллантай О.В., Дударь Г.Е., Ванг Л., Хуан Ч., Чойнзонов Е.Л., Чердынцева Н.В.
Журнал: Сибирский онкологический журнал @siboncoj
Рубрика: Лабораторные и экспериментальные исследования
Статья в выпуске: 1 т.25, 2026 года.
Бесплатный доступ
Патогенные мутации в генах репарации ДНК (таких как BRCA1/2, RAD50, RAD51D, PTEN и др.) ответственны за развитие наследственного рака молочной железы и яичников. Большое количество вариантов, выявляемых с помощью технологии NGS, имеют неизвестное или конфликтное клиническое значение. Реклассификация данных вариантов играет решающую роль в рутинной лабораторной практике. Целью исследования явилась реклассификация варианта конфликтного значения гена RAD51D (rs145309168), обнаруженного у молодой пациентки бурятского происхождения с раком молочной железы, с использованием нонсенс-опосредованного распада мРНК (NMD) с последующим секвенированием по Сэнгеру. Материал и методы. Полноэкзомное секвенирование (WES) было выполнено на ДНК, выделенной из цельной крови 16 пациенток с раком молочной железы бурятского этноса, у которых отсутствовали мутации в генах BRCA1/2 (данные не представлены). Диагноз пациенток подтвержден морфологически (T1–3N0–2M0). У всех обследованных женщин был диагностирован инвазивный (протоковый) рак молочной железы неспецифического типа. Патогенные варианты, ассоциированные с заболеванием, не выявлены. Далее были проанализированы редкие варианты (MAF-0,005) для оценки их влияния на сплайсинг РНК с использованием биоинформатических инструментов, таких как SpliceAI, ESEFinder, RESCUE-ESE и EX-SKIP. Редкий миссенс-вариант в гене RAD51D (rs145309168) был идентифицирован у 39-летней пациентки бурятского этноса с раком молочной железы. Замороженные лейкоциты этой пациентки были разделены на две группы: экспериментальную и контрольную. Образцы культивировали в течение 5–6 дней и обрабатывали пуромицином (только экспериментальную группу) в течение 4–6 ч перед выделением РНК для предотвращения NMD с последующим секвенированием по Сэнгеру. Результаты. In vitro эксперименты проводились на живых лейкоцитах пациентки с раком молочной железы, имеющей вариант c.932T>A гена RAD51D. Ампликоны кДНК были получены из РНК, выделенной из контрольных и экспериментальных лейкоцитов (обработанных пуромицином для предотвращения деградации, опосредованной NMD). Для точной оценки аберраций сплайсинга транскрипты экспериментальных лейкоцитов сравнивались с транскриптами контрольных культур лейкоцитов с помощью секвенирования по Сэнгеру. Последовательности транскриптов кДНК сравниваемых образцов в обоих случаях сохраняют изучаемый вариант, что указывает на то, что вариант не активирует NMD и, следовательно, не влияет на сплайсинг. Заключение. В данном исследовании впервые представлен in vitro анализ варианта RAD51D (rs145309168), найденного у молодой пациентки бурятского этноса с раком молочной железы. Наши экспериментальные данные демонстрируют, что вариант c.932T>A не нарушает нормальный сплайсинг, что служит основанием для реклассификации данного «Конфликтного варианта» на «Вероятно доброкачественный», что согласуется с литературными данными и данными ранних классификаций.
МРНК, ген репарации ДНК, RAD51D, рак молочной железы, этнические группы, буряты, неевропеоиды
Короткий адрес: https://sciup.org/140314346
IDR: 140314346 | УДК: 618.19-006.6:575.113 | DOI: 10.21294/1814-4861-2026-25-1-46-53
Functional analysis of the RAD51D gene conficting variant in breast cancer
Germline pathogenic variants in DNA repair genes (BRCA1/2, RAD50, RAD51D, PTEN and etc.) are responsible for the development of hereditary breast and ovarian cancers. The large number of variants detected by NGS technology have unknown or conficting clinical signifcance. Reclassifcation of these variants plays a crucial role in their application in routine laboratory practice. The aim of the current study was to reclassify conficting RAD51D gene variant (rs145309168) in a young Buryat breast cancer patient using the translation-dependent nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway. Material and Methods. Wholeexome sequencing (WES) was performed in the germline DNA of 16 non-BRCA BC Buryat patients (data not shown). The diagnosis in all patients was confrmed morphologically (T1–3N0–2M0). All tested women were diagnosed with invasive (ductal) carcinoma of no special type. Rare variants (MAF-0.005) were analyzed to assess their impact on the RNA splicing using in silico tools like SpliceAI, ESEFinder, RESCUE-ESE, and EX-SKIP. A rare missense variant in the RAD51D gene (rs145309168) was identifed in a 39-year-old Buryat breast cancer patient. Frozen patient leukocytes were divided into experimental and control samples. The samples were cultured for 5–6 days and treated with puromycin (only experimental samples) for 4–6 hours prior to RNA isolation to avoid NMD followed by Sanger sequencing. Results. In vitro experiments on live leukocytes from a breast cancer patient with the c.932T>A variant of the RAD51D gene were conducted. cDNA amplicons were obtained from RNA isolated from control and experimental leukocytes (treated with puromycin to avoid nonsense-mediated decay). For an accurate assessment of splicing aberrations, transcripts from the experimental leukocytes were compared to transcripts from control leukocytes by using Sanger sequencing. In both cases, the presence of the studied variant in the RNA signifed that the variant did not activate NMD and therefore did not affect splicing. Conclusion. This study presents the frst in vitro functional analysis of the RAD51D variant (rs145309168) identifed in a young Buryat breast cancer patient. Our experimental data demonstrate that this variant does not disrupt normal splicing, providing evidence for its reclassifcation as «Likely Benign», which is consistent with published data and previous classifcations.
