Изучение генетического разнообразия микросимбионтов копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. Setigerum, произрастающего в Прибайкалье

Ризобии — обширная, генетически разнородная группа грамотри-цательных микроорганизмов, обитающих в почве, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и осуществлять фиксацию атмосферного азота, образуя на корнях растений-хозяев клубеньки, из-за которых эти микроорганизмы известны также как клубеньковые бактерии. Изучение механизмов (в том числе молекулярных), обеспечивающих взаимодействие бобовых растений с ризобиями, считается одной из актуальных задач современной микробиологии и биотехнологии и необходимо для проведения научно обоснованной селекции высокоэффективных растительно-микробных систем (1). Для понимания эволюции специфических растительно-микробных взаимодействий особое значение имеют симбиотические системы с участием реликтовых бобовых растений, представляющих собой промежуточное звено между исчезнувшими и современными видами. К таким уникальным объектам относится копеечник щетини-

^∗ Работа выполнена в рамках Программы ФАНО России по развитию и инвентаризации биоресурсных коллекций научными организациями (¹ ИСГЗ 0664-2016-0018). Секвенирование гена ITS региона микросимбионтов выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант ¹ 16-16-00080).

стый Hedysarum gmelinii Ledeb. subsp. setigerum (Turcz. ex Fischer et Mey.) Kurbatsky, произрастающий в Байкальском регионе (2). Ботанико-географический анализ показал принадлежность этого вида к плейстоценовым петрофитно-степным реликтам южносибирского происхождения (3, 4).

В литературе имеются данные о том, что из клубеньков копеечника колючейшего ( Hedysarum spinosissimum subsp. capitatum ) и некоторых других видов этого рода ( H. pallidum, H. carnosum ), произрастающих в Средиземноморском регионе, выделяются бактерии, принадлежащие к классу Gammaproteobacteria , — Pantoea agglomerans , Enterobacter kobei , Enterobacter cloacae , Leclercia adecarboxylata , Escherichia vulneris и Pseudomonas sp . (5). Копеечник венечный H. coronarium нодулируется штаммами Rhizobium sul-lae (6). По данным китайских исследователей (7), из клубеньков видов копеечника H. scoparium и H. polybotrys , произрастающих на северо-западе Китая, выделяются представители рода Rhizobium . В 2011 году было показано, что растения копеечника альпийского H. alpinum нодулируется представителями рода Mesorhizobium (8).

Микросимбионты копеечника щетинистого ранее никогда не выделялись. В настоящей работы мы создали и описали первую в мире коллекцию ризобиальных микросимбионтов этого реликтового бобового растения, произрастающего в Прибайкальском регионе.

Цель нашей работы состояла в выделении микросимбионтов Hedys-arum gmelinii subsp. setigerum и определении таксономического положения штаммов с помощью ITS-RFLP метода и секвенирования последовательностей 16S рДНК.

Методика . Объектом исследования были 19 штаммов, изолированных с помощью традиционной методики (9) из корневых клубеньков копеечника щетинистого, произрастающего на мысе Зундук (материковое побережье байкальского пролива Малое море, координаты 53.383333, 107.41666753°23 ′ 00 ″ с.ш. 107°25 ′ 00 ″ в.д.). Микроорганизмы выращивали на модифицированном маннитно-дрожжевом агаре YMSA с добавлением 0,5 % янтарной кислоты (10) при 28 °С. Все изоляты депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) и размещены на Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов (Liconic Instruments, Лихтенштейн) (11). Информация о штаммах доступна в Интернет-базе данных ВКСМ (12).

При первичной оценке внутривидового разнообразия штаммов проводили RFLP (restriction fragment length polymorphism) анализ последовательности между генами 16S и 23S рРНК (ITS-RFLP метод). Для этого амплифицированный фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазой MspI («Promega», США) и разделяли рестрицированные ДНК-фрагменты электрофорезом в стандартном режиме (13). Для определения видовой принадлежности штаммов использовали нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК ( rrs ).

Для амплификации ITS региона (800 п.н.) использовали праймеры FGPS1490-72 (5'-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3') и FGPL-132 (5'-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3'), для амплификации 16S рДНК (около 1500 п.н.) — праймеры fD1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rD1 (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'). Полученный ПЦР-продукт выделяли из геля и очищали (14) для последующего RFLP-анализа или секвенирования на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl («Applied Biosystems», США). Поиск гомологичных последовательностей выполняли с помощью базы данных NCBI GenBank и программы BLAST (15). Для конструирова- ния филогенетического дерева применяли программу MEGA5 и метод Neighbor-Joining (16). Пары последовательностей сравнивали по числу различающихся нуклеотидов. Для оценки уровней поддержки кластеров был проведен бутстреп-анализ на основе 1000 повторов. Полученные последовательности депонированы в базе данных GenBank под номерами KY290459-KY290467, KY290469, KY290470 и KY290472-KY290474.

Результаты . Изоляты, относящиеся к клубеньковым бактериям, представлены в таблицах 1 и 2.

1. Гомология (%) гена 16S рРНК у быстрорастущих изолятов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, и у типовых штаммов родов Phyllobacterium и Rhi-zobium

Типовой штамм	Изолят
	Rhizobium sp.	Ph. loti			Ph. endophyticum		Phyllobacterium sp.
	Hse-26	Hse-9 Hse-19 Hse-30			Hse-10	Hse-24	Hse-131 Hse-141 Hse-171 Hse-201Hse-29
1	95,7	98,3	98,3	98,2	97,4	97,1	99,9	96,9	98,6	98,3	98,7
2	94,5	99,6	99,6	99,5	97,9	97,7	99,6	97,4	98,9	99,7	98,9
3	94,9	99,1	99,1	99,0	97,1	96,8	99,9	96,6	98,1	99,2	98,1
4	94,6	98,6	98,6	98,6	96,6	97,1	99,2	96,1	97,7	98,6	97,7
5	94,3	98,6	98,1	98,6	99,9	99,6	99,4	99,3	98,8	98,6	98,9
6	95,1	98,5	98,6	98,4	98,5	98,2	99,6	98,0	99,3	98,6	99,3
7	95,1	99,8	99,8	99,8	98,5	98,3	99,6	98,0	99,0	99,8	99,1
8	98,9	94,4	94,4	94,3	93,5	93,3	95,0	93,1	94,8	94,4	94,8
9	96,4	93,5	93,5	93,5	92,5	92,3	93,4	92,2	93,8	93,6	93,8

П р и м еч а ни е. 1 — Ph. myrsinacearum STM 948T, 2 — Ph. trifolii PETP02T, 3 — Ph. ifriqiyense STM 370T, 4 — Ph. catacumbae CSC19T, 5 — Ph. endophyticum PEPV15T, 6 — Ph. brassicacearum STM 196T, 7 — Ph. loti S658T, 8 — Rh. giardinii NBRC 107135, 9 — Rh. alamii GBV016T.

2. Гомология (%) гена16S рРНК у медленнорастущих изолятов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, и у типовых штаммов рода Bosea

Типовой штамм	Изолят Bosea sp.
	Hse-21	1       Hse-22       1	Hse-32
B. vaviloviae Vaf-18T	98,5	98,0	98,5
B. massiliensis 63287T	98,4	97,5	98,4
B. eneae 34614T	98,6	97,7	98,6
B. vestrisii 34635T	98,6	97,7	98,6

По скорости роста все исследованные изоляты разделились на две группы: у трех штаммов видимые колонии образовывались на среде YMSA на 4-5-е сут, у остальных — на 3-и сут. Поскольку каждый изолят генерировал уникальный ITS-RFLP профиль (данные не приведены), все исследуемые штаммы стали объектом идентификации с помощью секвенирования гена rrs .

Анализ последовательности, показал, что 11 быстрорастущих штаммов принадлежат к родам Phyllobacterium и Rhizobium и формируют 3 статистически достоверно различающиеся кластера с уровнем поддержки 100 % (рис. 1). Первый кластер включал штаммы Hse-14, Hse-24 и Hse-10, а также типовой штамм Ph. endophyticum PEPV15T. Штаммы Hse-24 и Hse-10 были идентифицированы как Ph. endophyticum , показаd высокую гомологию гена rrs с таковым у типового штамма PEPV15T (соответственно 99,6 и 99,9 %). Штамм Hse-14 был описан как Phyllobacterium sp. (табл. 1). Второй кластер объединил штаммы Hse-29, Hse-17, Hse-20, Hse-30, Hse-19, Hse-9, Hse-13 и типовые штаммы Ph. sophorae CCBAU03422T, Ph. bour-gognense STM201T, Ph. brassicacearum STM 196T, Ph. loti S658T, Ph. trifolii PETP02T, Ph. catacumbae CSC19T, Ph. myrsinacearum STM 948T и Ph. ifriqiyense STM 370T (рис. 1). Штамм Hse-20 идентифицировали как Phyllobacterium sp., поскольку по гену rrs он был наиболее близок к двум видам 1006

92 Г

—Hse-14 (KY290462)

Hse-24 (KY290469)

Lra. sophorae CCBAU 03422T (KJ685937)

I— Ilse-10 (KY290460)

Ph^Uobacterium endophytic™

PEPV15T (NR 109517)

Ph. bourgognense STM 201T (NR043191)

Ph. brassicacearum. STM 196T (NR043190)

Hse-29 (KY290472)

Ilse-17 (KY290463)

Ph. loti S658T (NR133818)

Ph. tri/olii PETP02T (NR043193)

¹⁰⁰ Hse-20 (KY290465)

39 Hse-30 (KY290473)

Hse-19 (KY290464)

Hse-9 (KY290459)

’ ' Ph. myrsinacearum STM 948T (AY785315)

• -    —Ph. eatacumbae CSC19T (NR043055) 64

gL-Hse-13 (KY29046I)

Ph. ijriqiyense STM 370T (XR043192)

Ю0 । Hse-26 (KY290470)

।-----Rhigobium giardinii NBRC 107135T (AB682469)

---Rh. alamii GBV016T (AM931436)

• —    Rh. leguminosarum USDA2370T (U29386)

• ■    ---Rh. etii CPN 42 (U28916)

0.01

----99 I---- Rh. mongotense USDA1844T (U89817)

₆₀T---- Rh. gallicum R602spT (U86343)

521 _m yanglingense SH22623T (AP003375)

I----------------------------------------------1

Рис. 1. rrs -Филограмма быстрорастущих штаммов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, а также представителей родственных видов Phyllobacterium и Rhizobium. Полученные изоляты обозначены как Hse, типовые штаммы отмечены литерой «Т».

(степень гомологии с типовыми штаммами Ph. trifolii PETP02T и Ph. loti S658T составляла соответственно 99,7 % и 99,8 %). Степень сходства гена rrs у штаммов Hse-9, Hse-19 и Hse-30 и типового штамма Ph. loti S658T достигала 99,8 %. На этом основании перечисленные штаммы были описаны как Ph. loti (см. табл. 1). Наиболее близким к изолятам Phyllobacterium sp. Hse-17 и Hse-29 оказался типовой штамм Ph. brassicacearum STM 196T (99,3 % гомологии по гену rrs ) . Изолят Hse-13 показал 99,9 % сходства с двумя типовыми штаммами Ph. myrsinacearum STM 948T и Ph. if-riqiyense STM 370T, поэтому был идентифицирован только до рода — Phyllobacterium sp. (см. табл. 1). Третий кластер сформировали штамм Hse-26 и типовой штамм Rhizobium giardinii NBRC 107135. На основании результатов секвенирования гена rrs (см. табл. 1) изолят Hse-26 был идентифицирован как Rhizobium sp. (степень сходства с типовым штаммом Rhizobium giardinii NBRC 107135 — 98,9 %).

На рисунке 2 представлена rrs -филограмма, отражающая таксономическое положение трех медленнорастущих ризобиальных изолятов в пределах семейства Bradyrhizobiaceae . По гену rrs штаммы Hse-21 и Hse-32 1007

__Bradyrhiyrbium daqingense CCBAU 15774T (HQ231274)

-----Br. yuanmingense CCBAU 10071T (NR028768)

Br. canariense ВТЛ-1Т (NR042177)

Br. japonicum USDA 6T (NR112552)

Br.jieamae PAC68T (NR043036)

______ Br. pachyrhKi PAC48T (NR043037)

Br. retamae LMG 27393T (KC247085)

Br lablabi CCBAU 23086T (GU433448)

84 , Br. huanghuaihaiense CCBAU 23303T (HQ231463)

Br. irtomotense LMG 24129T (AB300992)

|— Br betae NBRC 103048T (AB681928)

- _r Br. arachidis CCBAU 0511071 (HM107167)

93I Br. cytisi CTAW11T (EU561065)

Tardiphaga robiniae LMG 26467T

------------(FR753O34)

Rhodopseudomonas patmtris ATCC 17001T (NR114498)

___________Bosea minatitlanensis AMX51T (AF273081)

B. thiooxidans DSM 9653T (NR041994)

B. massiliensis 63287T (AF2883O9)

751 Hse-22 (KY290467)

99 П Hse-32 (KY290474)

LHse-21 (KY290466)

|— B. vaviloviae Vaf-18T (NR136423) ' A eneae 34614T(AF288300)

97 1д vestrkii 34635T (AF2883O6)

0,01

Рис. 2. rrs- Филограмма медленнорастущих штаммов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii subsp. setigerum в Прибайкальском регионе, а также представителей родственных видов Bosea . Полученные изоляты обозначены как Hse, типовые штаммы отмечены литерой «Т».

показали 98,5 % гомологии с типовым штаммом Bosea vaviloviae Vaf-18T и 98,6 % — с типовыми штаммами B. eneae 34614T и B. vestrisii 34635T (см. табл. 2). Сходство по гену rrs у изолята Hse-22 и наиболее близкого типового штамма B. vaviloviae Vaf-18T составляло 98,0 % (см. табл. 2). На этом основании штаммы Hse-21, Hse-22 и Hse-32 были идентифицированы как Bosea sp. Следует отметить, что вид B. vaviloviae описан совсем недавно (в 2015 году) для трех штаммов-микросимбионтов реликтового бобового растения Vavilovia formosa, произрастающего в Северной Осетии (10). Кроме того, из клубеньков других видов копеечника, произрастающих в Средиземноморье, северо-западных районах Китая и средней полосе России, микроорганизмы родов Bosea и Phyllobacterium не выделялись (5-8).

Способность каких-либо представителей рода Bosea формировать азотфиксирующий симбиоз ранее не подтверждалась, хотя штаммы четырех видов (B. lupini, B. lathyri, B. robiniae и B. vaviloviae) были изолированы из клубеньков бобовых растений соответственно родов Lupinus, Lathyrus, Robinia и Vavilovia (10, 17). Однако по крайней мере два вида рода Phyllobacterium (Ph. sophorae и Ph. trifolii) описаны как эффективные микросимбионты рас- тений Sophorae flavescens (18), Trifolium repens и Lupinus albus (19). Поэтому байкальские изоляты, принадлежащие роду Bosea и имеющие высокую степень сходства с видом B. vaviloviae, а также бактерии рода Phyllobacterium представляют большой интерес для дальнейшего изучения.

Анализ последовательностей гена rrs у пяти неризобиальных изоля-тов, выделенных из клубеньков копеечника щетинистого, показал их принадлежность к родам Acinetobacter , Stenotrophomonas , Sphingomonas и Agro-myces (данные не приведены). Бактерии рода Stenotrophomonas были изолированы и из других бобовых растений Байкальского региона (20). По данным литературы, представители этих родов могут присутствовать в клубеньках бобовых, а также быть обитателями ризосферы и филлосферы различных видов растений (21-25).

Таким образом, в настоящей работе мы впервые получили коллекцию штаммов, изолированных из реликтового бобового растения копеечника щетинистого Hedysarum gmelinii Ledeb. subsp. setigerum , произрастающего в Байкальском регионе. В результате нашего исследования было показано, что среди микросимбионтов этого растения встречаются штаммы симбиотических видов клубеньковых бактерий ( Rhizobium sp.), а также нетипичные виды, представители которых не формируют симбиоз ( Phyllobacterium endophyticum, Ph. loti и Bosea sp.). Штаммы несимбиотических ри-зобиальных видов, возможно, присутствуют в клубеньках как носители генов, не участвующих непосредственно в формировании симбиоза, но влияющих на его эффективность. Дальнейшее фенотипическое и генетическое исследование выделенных микроорганизмов может внести существенный вклад в понимание путей эволюции и становления растительномикробных взаимодействий в бобово-ризобиальной системе.

Авторы благодарят А.В. Верхозину (СИФИБР СО РАН) за помощь в организации экспедиции в Прибайкальский регион.