Изучение генетического сходства донских аборигенных сортов винограда с применением SSR-анализа и по основным ампелографическим признакам листа

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Администрации Краснодарского края (грант ¹ 13-04-96541р_юг_а).

Аборигенные, стародавние сорта из различных регионов возделывания винограда, как и дикие формы, — наиболее ценная часть мирового генофонда культуры Vitis vinifera L. Именно автохтонные сорта, многие из которых не имеют даже локального распространения, могут быть безвозвратно утеряны. Их генотипы содержат редкие аллели и характеризуются уникальными адаптивными свойствами к конкретным зонам виноградарства. По этой причине изучению аборигенного генофонда уделяется особое внимание во всех производящих виноград странах (1-6).

История виноградарства на Дону насчитывает несколько веков. Местные сорта винограда многообразны и специфичны. Многие из них представляют значительную ценность и для возделывания в благоприятных условиях правобережья Дона, и для селекционной работы (7). Единого мнения о происхождении донских сортов винограда нет, однако чисто местные названия и общность признаков свидетельствуют об их давности. На местное происхождение большинства донских аборигенных сортов указывает и формирование в разных микрорайонах виноградарства групп сортов, близких по основным морфологическим признакам.

На основании сходства признаков (листьев и формы ягод) было установлено, что сорта Косоротовский, Сибирьковый, Пухляковский черный, Ольховский, Сиволистный, Бессергеневский ¹ 7 — естественные сеянцы сорта Пухляковский белый (7). А.И. Потапенко считает, что сорт Пухляковский белый появился на Дону в начале XIX века (8). А.М. Алиев, напротив, утверждает, что большая группа сортов винограда не могла возникнуть и распространиться за такой короткий период (9). По его мнению, Пухляковский белый был известен на Дону значительно раньше и относится к аборигенным донским сортам. Группа сортов, близких к Пухляковскому белому, — не единственная. Выделяют и более многочисленную группу так называемых цимлянских сортов, сходных по морфологическим признакам.

При установлении происхождения сортов винограда народной селекции немаловажное значение имеют методы их идентификации. Исследования показали результативность использования унифицированной системы описания сортов винограда, разработанной Международной организацией винограда и вина (Office International de la vigne et du vin, OIV, Париж, Франция) (10). Эта система облегчает оценку близости признаков и тем самым помогает подтвердить или опровергнуть предполагаемое происхождение сорта. Наибольшую ценность имеют основные признаки листьев, при формировании которых практически исключено воздействие искусственного отбора (7). В зависимости от длины побега и условий произрастания величина и форма листьев различаются в пределах одного и того же сорта, однако эти параметры остаются надежным ампелографическим признаком.

Исследования ДНК — наиболее информативный метод анализа генотипов растений. ДНК-профили дополняют традиционное описание и агробиологические характеристики сортов, позволяя точно идентифицировать сорта, изучать их происхождение, выявлять синонимы и примеси в коллекциях. В работах по изучению генетического разнообразия и идентификации сортов чаще всего используют маркерные системы, основанные на вариабельности микросателлитных участков ДНК.

Микросателлиты (simple sequence repeats, SSR) — тандемные повторы простых последовательностей в структуре ДНК. Источник их полиморфизма — сайт-специфическое варьирование длины повтора, обусловленное различием в числе его единиц (11). Микросателлитные последова- тельности распространены повсеместно в геноме высших растений. Для SSR-маркеров характерны кодоминантный тип наследования, высокая дифференцирующая способность и воспроизводимость результатов. Мик-росателлитные маркеры широко используются для генотипирования сортов и подвоев винограда (12-16), а также успешно применяются при изучении происхождения сортов и анализа их родословных (17-22). На основании работ по фингерпринтингу сортов винограда, проведенных в различных лабораториях, сформирован основной стандартный набор SSR-маркеров для генотипирования Vitis vinifera (23).

В настоящей работе мы впервые провели оценку родства аборигенных донских сортов винограда, преимущественно из групп цимлянских сортов и сеянцев Пухляковского белого, на основе анализа ДНК.

Целью нашей работы было изучение генетического сходства донских сортов по данным анализа полиморфизма микросателлитных локусов и сопоставление полученных результатов с выводами других авторов о происхождении сортов, а также с данными анализа основных признаков сформировавшегося листа.

Методика. Исследования проводили на выборке аборигенных донских сортов винограда — Безымянный донской, Бессергеневский ¹ 7, Косоротовский, Кукановский, Махроватчик, Плечистик, Плечистик обоеполый, Пухляковский белый, Пухляковский черный, Сибирьковый, Сиво-листный, Старый горюн, Сыпун черный, Цимладар, Цимлянский белый, Цимлянский черный, произрастающих в коллекции Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко (г. Новочеркасск) и в Российской ампелографической коллекции (г. Анапа). Контрольными сортами служили Шардоне и Каберне-Совиньон, аллельный состав которых по изучаемым SSR-локусам известен (23). Все сорта были описаны по основным ампелографическим признакам сформировавшегося листа согласно методике проведения испытаний на отличимость, однородность и стабильность, предложенной для винограда (9).

Основным методом, применяемым в работе, была полимеразная цепная реакция (ПЦР). Разделение продуктов ПЦР осуществляли посредством электрофореза как в 2 % агарозном геле (при оптимизации параметров ПЦР), так и методом капиллярного электрофореза с использованием автоматического генетического анализатора ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США) при выполнении SSR-фингерпринтинга генотипов.

В исследовании были использованы SSR-маркеры VVMD5, VVMD7, VVMD27, VVS2, VrZAG62 и VrZAG79, рекомендованные для молекулярно-генетической паспортизации генотипов Vitis vinifera Европейской базой данных и проектом GrapeGen06 (23). ДНК выделяли из молодых листьев апикальной части побегов 4-5 типичных кустов сорта CTAB-методом (с использованием бромистого цетилтриметиламмония) (24). Состав ПЦР-смеси формировали согласно стандартному протоколу, реакцию проводили по стандартным параметрам, экспериментально подобрав температуры отжига праймерных пар (25). Размеры амплифицированных фрагментов определяли на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 3130. Результаты обрабатывали в программе Gene Mapper 4.1.

Матрицу генетических дистанций строили с использованием коэффициентов (индексов) подобия по M. Nei и W. Li (26). Кластерный анализ выполняли методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием FreeTreeAppli-cation 0.9.1.50 (ZDATv.o.s.). Графическое построение дендрограмм проводили в программе TreeView (Win32) 1.6.6.

Махроватчик

Цимлянский белый

Сыпун черный

Плечистик

Плечистик обоеполый

Цимладар

Безымянный донской

Цимлянский черный

Бессергеневский № 7

Старый горюн

Кукановский

Косоротовский

Пухляковский черный

Сиволистный

Пухляковский белый

Сибирьковый

Рис. 1. Дендрограмма генетического сходства между изученными донскими сортами винограда ( Vitis vi-nifera L.) на основе данных SSR-анализа (коллекция Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко, Российская ампелографиче-ская коллекция).

Данные по морфологическим признакам листьев, а также результаты SSR-генотипирования анализировали с помощью метода главных координат (PCA). Расчеты осуществляли в программе PAST v. 2.17c.

Результаты. Изученная выборка была представлена в основном сортами винограда, относящимися к двум группам, ранее выделенным уче-ными-ампелографами, — группе цимлянских сортов и группе естественных сеянцев сорта Пухляковский белый.

Для снижения себестоимости анализов после апробации SSR-маркеров и подбора оптимальных параметров ПЦР были сформированы наборы для мультиплексного анализа. SSR-маркеры объединяли с учетом диапазона размеров амплифицируемых фрагментов по каждому локусу и температур отжига праймерных пар, используя в одном наборе два флуоресцентных красителя из четырех (FAM, R6g, Rox или Tamra). Генотипирование сортов проводили следующими маркерными парами: VVS2 + VVMD7; VVMD27 + VVMD5; VrZAG62 + VrZAG79.

По результатам анализа полиморфизма микросателлитных локусов каждый сорт показал ДНК-профиль, отличный от других образцов. По изучаемым SSR-локусам в выборке донских сортов винограда было определено шесть (по локусам VVS2, VVMD5, VVMD7, VrZAG62) и семь (по локусам VVMD27, VrZAG79) аллелей на локус.

Кластерный анализ на основе данных фингерпринтин-га по микросателлитным локусам позволил разделить сорта на две основные ветви (рис. 1). В одну ветвь вошли сорта Си-бирьковый, Пухляковский белый, Сиволистный, Пухляков-ский черный, Косоротовский и Кукановский. Все они обладали генетическим сходством, что подтверждает предположение об их происхождении от сорта Пу-хляковский белый, причем наиболее близкими по результатам микросателлитного анализа оказались сорта Сибирько-вый, Пухляковский белый и Сиволистный.

Во вторую ветвь вошли следующие сорта: Безымянный донской, Плечистик обоеполый, Старый горюн, Цимлянский белый, Цимлянский черный, Цим-ладар, Плечистик, Сыпун черный, Махроватчик и Бессерге-невский ¹ 7. Интересно, что в этой ветви выделились три подгруппы. В так называемой подгруппе цимлянских сортов мож но говорить о генетическом сходстве сортов Безымянный донской, Плечи-стик обоеполый, Цимлянский белый, Цимлянский черный, Цимладар, Плечистик, Сыпун черный. Сорта Плечистик и Плечистик обоеполый оказались наиболее генетически близки. Сорт Махроватчик показал сходство с группой цимлянских сортов. Сорта Бессергеневский ¹ 7 и Старый горюн были ближе друг к другу, чем к другим предположительно родственным им сортам, однако оба они по результатам микросателлитного анализа оказались ближе к цимлянской группе. Если учитывать, что по ампелографическим признакам сорт Бессергеневский ¹ 7 считают сеянцем Пухляковского белого, то можно предположить, что другим его родителем был сорт из группы цимлянских сортов или близкий им.

Более точные выводы могут быть сделаны при увеличении числа анализируемых SSR-локусов. Однако даже используемый в работе набор микросателлитных маркеров позволил получить результаты, сопоставимые с заключениями других ученых.

Основные ампелографические признаки листьев у аборигенных донских сортов винограда ( Vitis vinifera L.) (коллекция Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко, Российская ампелографическая коллекция)

Сорт	Код признака
	080	077-1	077-2 1 078-1	078-2 1 068 л 067	065	082	079	084	093

Естественные сеянцы сорта Пухляковский белый

Пухляковский

белый	3	5	3	5	3	3	4	5	2, 3	5	5	3, 2
Косоротовский	5	3	3	5	5	3	3	5, 7	2	5, 8	7	4
Сиволистный Пухляковский	3	5	5	5	5	3	3, 4	5, 7	2, 3	5, 6	5	2
черный Бессергеневский	3	3	3	5	3	3	4	5, 7	2,3	5, 8	3	2
¹ 7	3	3	3	5	5	2, 3	4	7	1	6	5	3
Кукановский	5	5	3	5	3	3	4	5	2, 3	3, 5	3, 5	2
Сибирьковый Безымянный	7	5	5 Группа	5 цимл	5        3 янских		4 сортов	5, 7	2	5	5	2, 3
донской Плечистик обое-	3	5	3	5	5	3	4	5	2, 3	5, 8	7	2
полый	3	3	3	7	7	3	4	5, 7	2	5, 6	7	2
Старый горюн Цимлянский	3	7	3	7	5	3	3	7	2	5	7	2
белый Цимлянский	3	5	3	7	5	3	4	5, 7	2	5, 8	3, 5	3, 4
черный	3	3	3	5	5	3	4	7	2	5	7	4
Цимладар	7	7	5	5	5	3	4	5	3, 4	8	5, 7	2
Плечистик	7, 9	5	5	5	5	3	4	7	2	5	7	2, 3
Сыпун черный	7, 9	5	3 Сеянец	5         5 сорта		3 Кокур	4 белый	5, 7	2	5	5	3
Махроватчик	9	7	5	7	7	3	4	5, 7	2, 4	5, 6	7	2

П р и м еч а ни е. 080 — глубина верхних боковых вырезок, 077-1 — длина верхушечного зубчика, 077-2 — длина бокового зубчика, 078-1 — отношение длины верхушечного зубчика к его ширине, 078-2 — отношение длины бокового зубчика к его ширине, 068 — число лопастей, 067 — форма пластинки, 065 — размер пластинки, 082 — расположение лопастей верхних боковых вырезок, 079 — расположение лопастей черешковой выемки, 084 — паутинистое опушение между главными жилками на нижней стороне пластинки, 093 — длина черешка по отношению к длине средней жилки. Цифры в таблице означают степень выраженности признака (10).

Основные ампелографические признаки сформировавшегося листа для каждого сорта были описаны нами по системе индексов в соответствии с методикой, принятой Международной организацией винограда и вина (табл.). Анализ полученных данных по основным признакам листьев проводили методом главных координат. Нами не было обнаружено закономерностей, соответствующих предполагаемому происхождению сортов или результатам SSR-анализа: область распределения сортов из группы сеянцев Пухляковского белого значительно перекрывалась с областью распределения сортов цимлянской группы (рис. 2, А).

В то же время по результатам SSR-анализа большинство сортов оказались распределены в пространстве главных координат в соответствии 64

с ранее сделанными выводами об их происхождении (см. рис. 2, Б). Выделенные области I и II соответствовали кластерам, полученным при UP-GMA кластеризации.

Рис. 2. Распределение изученных донских сортов винограда ( Vitis vinifera L.) в пространстве главных координат по результатам оценки признаков листовой пластинки (А) и SSR-анализа (Б) : 1 — Сибирьковый, 2 — Пухляковский белый, 3 — Сиволистный, 4 — Пухля-ковский черный, 5 — Косоротовский, 6 — Кукановский, 7 — Бессергеневский ¹ 7 (естественные сеянцы сорта Пухляковский белый); 8 — Безымянный донской, 9 — Плечистик обоеполый, 10 — Старый горюн, 11 — Цимлянский белый, 12 — Цимлянский черный, 13 — Цимладар, 14 — Плечистик, 15 — Сыпун черный (группа цимлянских сортов); 16 — Махро-ватчик (сеянец сорта Кокур белый); I и II — кластеры, полученные методом UPGMA (коллекция Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко, Российская ампелографическая коллекция).

Таким образом, основные признаки сформировавшегося листа недостаточны для оценки родства тех или иных генотипов винограда. Применение микросателлитных маркеров для этих целей более эффективно. ДНК-маркеры позволяют за достаточно быстрый период времени сделать выводы о генетическом сходстве образцов, подтвердить или опровергнуть информацию о происхождении. То есть наиболее информативной может считаться оценка коллекций, стародавних сортов, селекционного материала и интродуцируемых образцов по комплексу ампелографических признаков и SSR-маркерам.